Abstract

Megvizsgáltuk, hogy a melatonin hozzáadása az alprazolamhoz jobb premedikációs hatással bír-e, mint bármelyik gyógyszer önmagában. Egy prospektív, kettős vak, placebokontrollált vizsgálatban 80 felnőtt beteget (ASA 1&2), akiknél a szorongás vizuális analóg pontszáma (VAS) ≥3 volt, véletlenszerűen osztottunk ki arra, hogy az alprazolam 0,5 mg és a melatonin 3 mg kombinációját tartalmazó tablettát, alprazolam 0,5 mg-ot, melatonin 3 mg-ot vagy placebót kapjanak orálisan 90 perccel a standard altatás előtt. Az elsődleges végpontok a szorongás és a szedáció pontszámának változása volt 15, 30 és 60 perccel a premedikáció után, valamint azon betegek száma, akiknek a különböző időpontokban bemutatott öt képre vonatkozó emlékezetkiesése 24 óra elteltével értékelték. A vizsgálat során egyirányú ANOVA-t, Friedman-féle ismételt méréses varianciaanalízist, Kruskal Wallis és chi square teszteket alkalmaztak. A kombinált gyógyszer okozta a szorongás VAS maximális csökkenését (3 (1,0-4,3)) a kiindulási értékhez képest 60 perc alatt (). A szedációs pontszámok a különböző időpontokban és azon betegek száma, akik nem ismerték fel a premedikáció után 60 perccel mutatott képet, összehasonlítható volt a kombinált gyógyszer és az alprazolám önmagában. A melatonin hozzáadása az alprazolámhoz jobb anxiolízist eredményezett, mint a gyógyszerek önmagukban vagy a placebóhoz képest. A melatonin hozzáadása nem rontotta sem a szedációs pontszámot, sem a csak alprazolám amnéziás hatását. Ezt a vizsgálatot a ClinicalTrials.gov-on regisztrálták, jóváhagyták és közzétették. Azonosító száma: NCT01486615.

1. Bevezetés

A benzodiazepinek a legnépszerűbb műtét előtti gyógyszerek közé tartoznak, hogy anxiolízist, amnéziát és szedációt hozzanak létre a műtétre érkező betegek számára . A benzodiazepinekről azt jelentették, hogy paradox módon az alvás közbeni fokozott ébredési epizódokkal, nyugtalansággal és másnapossági hatásokkal járnak . Az alprazolam, a benzodiazepin osztályba tartozó antipszichotikus gyógyszerek közül az alprazolam szorongásszelektívebb, mint az e csoportba tartozó többi premedikáns, mint a midazolam, a lorazepam vagy a diazepam . A beszámolók szerint arousal epizódokat is mutat .

A melatonin (N-acetil-5-metoxitriptamin), egy endogén tobozhormon, ha szájon át adják premedikánsként, szintén műtét előtti anxiolízist és szedációt eredményez . Nem rontja sem a kognitív és pszichomotoros készségeket, sem a felépülés minőségét . Anxiolitikus, szedatív, hipnotikus, analgetikus, gyulladáscsökkentő, antioxidatív és kronobiotikus tulajdonságai vonzó alternatív premedikánsként különböztetik meg .

A benzodiazepinek az endogén melatoninszint elnyomásával járnak, hogy valószínűleg az alvás alatti fokozott ébredési epizódok, a nyugtalanság és a másnaposság hatásait mutassák . Feltételezzük, hogy az alprazolam által okozott arousal epizódok csökkenthetők az exogén melatoninnal való kombinálásával, így elősegítheti az egészséges alvást, hogy javítsa a műtét előtti stresszt. Tudomásunk szerint a melatonin és az alprazolam kombinációját premedikánsként még nem értékelték. Ezért terveztük ezt a prospektív, randomizált, kettős vak, placebokontrollált faktoriális vizsgálatot annak felmérésére, hogy a melatonin hozzáadása az alprazolámhoz rendelkezik-e bármilyen előnnyel az alprazolámmal vagy a melatoninnal önmagában szemben a premedikációban.

2. Módszerek

Az intézményi kutatási etikai bizottság jóváhagyását és minden egyes beteg írásbeli beleegyezését követően nyolcvan ASA 1-es és 2-es, 18 és 65 év közötti, három vagy annál magasabb szorongásos VAS-pontszámmal rendelkező beteget vizsgáltunk, akiket laparoszkópos cholecystectomia céljából általános érzéstelenítésben terveztek részesíteni. A fájdalomcsillapítót, nyugtatót, antiepileptikumot vagy antidepresszánst szedő, elhízott (BMI ≥ 28) vagy neuropszichiátriai betegségben szenvedő, a vizsgálati gyógyszerekre allergiás betegeket kizártuk.

A betegeket számítógépen generált véletlen számok segítségével, amelyeket a beleegyezés megszerzéséig eltitkoltunk, a négy, egyenként húszfős csoport egyikébe soroltuk. Az első csoportba tartozó betegek olyan tablettát kaptak, amely orális alprazolam (0,5 mg) és melatonin (3 mg) kombinációját tartalmazta. A kettes csoportba tartozó betegek alprazolámot (0,5 mg) kaptak. A hármas csoportba tartozó betegek melatonint (3 mg) kaptak. A négyes csoportba tartozó betegek hasonló kinézetű placebo tablettát kaptak. Minden beteg csak egy tablettát kapott egy korty sima vízzel, körülbelül 90 perccel a műtét előtt.

Egy nappal a műtét előtt, az altatás előtti viziten minden betegnek elmagyarázták a vizsgálat jellegét és a különböző skálákat, amelyeket használni fognak. Szorongásszintjük felmérésére egy 10 cm-es lineáris vizuális analóg skálát (VAS) használtak. A VAS szorongási skála szélső értékeit a 0 végponton a “nincs szorongás”, a 10 cm-es végponton pedig a “szorongás olyan súlyos, amilyen csak lehet” értékkel jelölték. A szedációt egy ötfokozatú skálán értékelték (0 = éber, 1 = hangra ébred, 2 = enyhe tapintásos ingerlésre ébred, 3 = erőteljes tapintásos ingerlésre ébred, 4 = nem reagál), a tájékozódást pedig egy háromfokozatú skálán (0 = nincs, 1 = időben vagy térben való tájékozódás, 2 = mindkettőben való tájékozódás) . A memória tesztelésére öt különböző egyszerű kép és két esemény felidézését vizsgálták. A felhasználandó képeket a hátoldalon sorszámozták, az előlapra pedig a nevüket nyomtatták.

Körülbelül 90 perccel a műtét előtt minden beteget egy csendes szobába vittek. Noninvazív vérnyomás, szívfrekvencia, légzésszám és SpO2 monitorozásra került sor. Ezután az egyes képet (csésze egy tányéron) és a kettes képet (gyümölcsök) 10 perccel a gyógyszer beadása előtt, illetve közvetlenül a gyógyszer beadása előtt mutatták meg. A betegeket arra kérték, hogy a vizsgálati gyógyszert 15 ml sima vízzel szájon át vegyék be a csoportbeosztásnak megfelelően egy, a betegkezelésben vagy az adatgyűjtésben ezután részt nem vevő vizsgáló által. A szorongás, a szedáció és a tájékozódás pontszámait közvetlenül a gyógyszer beadása előtt, valamint 15 perccel, 30 perccel és 60 perccel a gyógyszer beadása után értékelték. Ezeken az időpontokban a hármas (madarak), négyes (nyúl), illetve ötös (autó) képeket is megmutatták.

A műtőben biztosították az intravénás hozzáférést, és 1 mg/kg meperidint adtak be intravénásan. Ezután intravénásan 20 mg lidokaint adtunk bólusban, majd 100 ml/h infúziós pumpán keresztül propofolt, amíg a szóbeli parancsra adott válasz elvesztését és a szempillareflex elvesztését nem észleltük. A megfelelő altatási mélység fenntartása érdekében 0,1 mg/kg vekuroniumot és oxigénben lévő izofluránt adtak. Az intubálás után a lélegeztetést a normokapnia fenntartására állították be. Az injekciós meperidin (0,1 mg/kg) és a vecuronium (0,02 mg/kg) inkrementális adagjait szükség szerint adták be. Intravénásan 75 mg diklofenák-nátriumot adtak lassan 15 perccel a műtét befejezése előtt posztoperatív fájdalomcsillapítás céljából. A műtét befejezése után intravénás neostigmint (50 μgm/kg) és glikopirrolátot (10 μgm/kg) adtak a maradék izombénulás visszafordítására. Az altatási időt (indukciótól az emergálásig) feljegyezték.

A lábadozóban a betegek a szokásos posztoperatív ellátásban részesültek, beleértve az oxigén adagolását arcmaszkkal (6 L/perc) és a szívfrekvencia, a légzésszám, a nem invazív vérnyomás és a SpO2 monitorozását. Megfigyeltük, hogy a következő 24 órában nem jelentkezett-e hányinger, hányás, szédülés, fejfájás és nyugtalanság. Intravénás ondansetron (4 mg) adása lassan történt a posztoperatív hányinger és hányás kezelésére.

A műtétet követő 24 óra elteltével a betegeket megkérdeztük, hogy emlékeznek-e a két eseményre, azaz a műtőbe szállításra és az intravénás kanül behelyezésére. Arra is megkérték őket, hogy szabadon emlékezzenek vissza arra az öt képre, amelyet megmutattak nekik. Ezután az elsőként mutatott öt képet öt új képpel (ló, cipő, kerékpár, elefánt és tigris) kevertük össze, és arra kértük őket, hogy ismerjék fel a műtét előtt mutatott képeket. Azt is megkérdezték tőlük, hogy szükség esetén a jövőben is szeretnék-e ugyanazt a premedikációs gyógyszert kapni.

Az elsődleges végpontok a szorongás, a szedáció és a tájékozódási pontszámok változása voltak a premedikációt követő különböző időpontokban, valamint azon betegek száma, akiknek 24 órával később elvesztették az öt képre vonatkozó emlékezetüket. A másodlagos végpont azon betegek száma volt, akik a jövőben szükség esetén ugyanazt a premedikációs gyógyszert kívánták kapni.

2.1. Statisztikai elemzés

A vizsgálat megkezdése előtt egy teljesítményelemzéssel (, 0,05; , 0,10) meghatározták a 16 betegből álló mintanagyságot minden csoportban, abból a feltételezésből kiindulva, hogy a kísérleti csoportokban a kiindulási értékhez képest 50%-kal, a placebocsoportban 4%-kal csökken a szorongás VAS értéke. A kieső esetek és az adatok normális eloszlásától való eltérés kompenzálására minden csoportban 20 esetet vizsgáltak.

Az adatokat Kolmogorov-Smirnov teszt segítségével teszteltük a normális eloszlásra. A csoportok közötti különbségek azonosítására a normális eloszlású folyamatos adatok esetében egyirányú varianciaanalízist (ANOVA), a kategorikus adatok esetében pedig chi-négyzetpróbát alkalmaztunk. Mivel a szorongás és a szedáció pontszámai nem voltak normális eloszlásúak; ezért azokat nemparametrikus statisztikai módszerekkel elemeztük. A különböző időpontok közötti értékek csoporton belüli összehasonlítására Friedman-féle ismételt méréses varianciaanalízist, majd Wilcoxon-teszteket alkalmaztunk Bonferroni korrekcióval. Az egyes időpontokban a csoportok közötti értékek összehasonlítására Kruskal Wallis-teszteket alkalmaztunk a Mann Whitney-teszttel végzett poszt hoc többszörös összehasonlításokkal. A parametrikus adatokat átlag ± SD, a nem parametrikus adatokat pedig mediánként (interkvartilis tartomány) fejeztük ki. A < 0,05 értéket szignifikánsnak tekintettük.

3. Eredmények

Száztíz beteget vizsgáltunk meg az alkalmasság szempontjából, 98 betegnél a szorongás VAS ≥ 3 volt. A 80 felvett beteg közül, akiket a premedikáció után két óráig figyeltek meg, a műtétet öt betegnél elhalasztották a műtéti idő rövidsége miatt. Ezeket a betegeket még aznap elbocsátották, és nem álltak rendelkezésre a premedikációt követő 24 órás értékeléshez (1. ábra). A négy csoport betegei összehasonlíthatóak voltak a demográfiai jellemzők és a perioperatív paraméterek tekintetében (1. táblázat).

1. ábra

Folyamatdiagram, amely a felvételt, kizárást, csoportbeosztást, beavatkozást és nyomon követést mutatja.

3.1. Folyamatdiagram. Jelentés a szorongásról

VAS szorongás pontszámok szignifikánsan () csökkentek a kiindulási értékhez képest a különböző időpontokban minden csoportban a melatonin és az alprazolám, az alprazolám, a melatonin} kivételével a placebo , ) (2. ábra). A Wilcoxon-tesztek Bonferroni korrekcióval (a hatások 0,0167-es szignifikanciaszinten jelentettek) azt mutatták, hogy ezek a csoporton belüli különbségek csak 30 perc és 60 perc múlva voltak szignifikánsak a kiindulási értékhez képest mindhárom csoportban.

2. ábra

A szorongás VAS (medián (IR)) változása a kiindulási értékhez képest az előkezelés után. , * = szélsőérték.

A csoportok közötti összehasonlítás során a szorongás VAS csökkenése a kiindulási értékhez képest csak a premedikációt követő 60 percben különbözött szignifikánsan , . E megállapítás nyomon követésére Mann Whitney-teszteket alkalmaztunk Bonferroni korrekcióval (a hatások 0,01-es szignifikanciaszinten jelentettek). A szorongás VAS {középérték (interkvartilis tartomány)} csökkenése csak a kombinált gyógyszereket {3(1,0-4,3)cm} és a placebót {0(0-1,7)cm} kapó csoportok között volt szignifikánsan eltérő. , ) (2. ábra).

3.2. Jelentés a szedációról

A szedációs pontszámok a kiindulási értékhez képest szignifikánsan emelkedtek a különböző időpontokban minden csoportban , a melatonin és alprazolám kombináció , , az alprazolám , , a melatonin} esetében, beleértve a placebót , ) (2. ábra). E megállapítás nyomon követésére Wilcoxon-teszteket alkalmaztunk Bonferroni korrekcióval; így minden hatásról 0,0167-es szignifikanciaszinten számolunk be. Míg a szedációs pontszám növekedése a kiindulási értékhez képest csak a placebónál volt szignifikáns 60 percnél, a többi három csoportban a premedikációt követő 30 és 60 percnél is szignifikáns volt a különbség.

Amikor a szedációs pontszámokat {medián (interkvartilis tartomány)} összehasonlítottuk a csoportok között, a különbség csak a premedikációt követő 60 percnél volt szignifikáns , . Mann Whitney-teszteket használtunk Bonferroni korrekcióval (a hatások 0,00714-es szignifikanciaszinten jelentettek) ennek a megállapításnak a nyomon követésére. A különbség csak a kombinált gyógyszereket {1 (1,0-1,75)} és a placebót {0 (0-1)} kapó csoportok között volt szignifikáns. , ), valamint a kombinált gyógyszereket {1 (1,0-1,75)} és a melatonint {0,5 (0-1), ) kapó csoportok között. A szedációs pontszámok részleteit a 2. táblázat tartalmazza.

. Melatonin és alprazolam () Alprazolam. () Melatonin () Placebo () Baseline Riasztás 18 (90) 20 (100) 17 (85) 20 (100) Hangra ébred 2 (10) 0 (0) 3 (15) 0 (0) 15 perc az előkezelés után Alert 13 (65) 16 (80) 13 (65) 18 (90) Hangra ébred 4 (20) 4 (20) 6 (30) 2 (10) Gyengéd tapintásos ingerléssel ébreszt 3 (15) 0 (0) 1 (5) 0 (0) 30 perc múlva. premedikáció Alert 7 (35) 10 (50) 9 (45) 15 (75) Hangra ébred 8 (40) 6 (30) 8 (40) 4 (20) Gyengéd tapintásos ingerléssel ébreszt 4 (20) 4 (20) 3 (15) 1 (5) Erős tapintási ingerléssel ébreszt 1 (5) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 60 min. premedikáció után Alert 3 (15) 6 (30) 10 (50) 12 (60) Hangra ébred 8 (40) 9 (45) 7 (35) 8 (40) Gyengéd tapintásos ingerléssel ébreszt 4 (20) 4 (20) 3 (15) 0 (0) Erőteljes tapintási ingerléssel ébreszt 5 (25) 1 (5) 0 (0) 0 (0)

2. táblázat

A szedációt mutatja a négy csoportban a premedikációt követő különböző időpontokban. Az értékek a betegek számában (%) vannak kifejezve.

3.3. Jelentés az orientációról

A premedikáció után 15, 30 és 60 perccel minden betegnél 2-es orientációs pontszámot ért el.

3.4. Jelentés az amnéziáról

A kombinált gyógyszereket és alprazolámot kapó csoportokban több páciens (egyenként 9) nem ismerte fel a premedikáció után 60 perccel mutatott képet, mint a melatonint és placebót kapó csoportokban (egyenként 2) (). Az alprazolam és melatonin kombinációját kapó csoportban a betegek legnagyobb számában két eseményre vonatkozó amnézia volt észlelhető. A különbség azonban statisztikailag szignifikáns csak a kombinált gyógyszereket kapó csoportok (5 (26%)) és a placebót (0) kapó csoportok között volt csak egy esemény (a műtőbe való eltolódás) esetében (3. táblázat).

3.5. A betegek megítélése

Az egy beteg kivételével, aki nem volt biztos benne, az alprazolam és melatonin kombinációját kapó összes beteg azt állította, hogy a jövőben is ugyanezt a premedikációt részesítené előnyben. Az alprazolámcsoportban két (11%), a melatonincsoportban öt (25%), a placebocsoportban pedig hat (33%) beteg fejezte ki, hogy a jövőben más premedikációra váltana.

3.6. Biztonságossági profil

A csoportok között nem volt statisztikai különbség a hányinger, hányás, szédülés, fejfájás vagy nyugtalanság előfordulását jelzők számában (1. táblázat).

4. Megbeszélés

Azt találtuk, hogy a melatonin-alprazolám kombináció nagyobb mértékben csökkentette a szorongás szintjét, mint bármelyik gyógyszer önmagában. Mindhárom premedikáns hamarabb elaltatta a betegeket, mint a placebo. A kombinált premedikáció nem rontotta a szedációt, mint az alprazolám. A melatonin-alprazolám kombinációt és az alprazolámot önmagában kapó betegeknél amnézia volt észlelhető. A melatonin-alprazolám kombinációt kapó betegek majdnem mindegyike a jövőben is ugyanazt a premedikációt részesítette előnyben. Mindhárom premedikációs gyógyszer biztonságos volt a műtétet követő 24 óráig megfigyelt mellékhatások tekintetében.

A benzodiazepinek a leggyakoribb premedikációs szerek a műtét előtt a műtét előtti szorongás enyhítésére . A benzodiazepinek fokozzák a gamma-amino-vajsav (GABA) neurotranszmitter hatását, hogy szedációt, anxiolízist, amnéziát, izomrelaxációt és görcsoldó hatást mutassanak. Egy belga vizsgálatban az orális alprazolam (0,5 mg) jelentős mértékű szedációt (szedáció VAS mm) eredményezett a placebóhoz képest (szedáció VAS mm) 60-90 perccel a premedikációt követően az egynapos sebészetre tervezett betegeknél . Betegeinknél az alprazolam a premedikációt követő 60 percben több szedációs pontszámot produkált, mint a placebo, de a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns. Az alprazolamot kapó betegeink azonban fél órával korábban szedálódtak, mint a placebóval kezeltek.

A melatonin az emberi szervezetben természetesen előforduló tobozhormon, amely a cirkadián ritmust szabályozza . Szintje az éjszakai alvás alatt magas . Az 1-5 mg melatonin szájon át történő beadása a plazmaszint 10-100-szorosát eredményezi a megfigyelt endogén éjszakai szinteknek . Az orális melatonin (5 mg) a jelentések szerint 60-90 perccel a premedikáció után jelentős szedációt okoz . Mi is azt találtuk, hogy a melatonin adása korábbi alváskezdethez társult, mint a placebohatás.

Érdekes módon minden betegünk a műtét előtti váróteremben való tartózkodás egy órájára szignifikánsan szedálttá vált a kiindulási szedációs pontszámhoz képest. Ez alátámasztható volt a csendes műtét előtti váróteremben való izolált tartózkodásukkal, ahová a vizsgálat céljából áthelyezték őket.

Megállapítottuk, hogy a melatonin hozzáadása az alprazolámhoz jobban csökkentette a szorongás szintjét, mint a két gyógyszer önmagában adott bármelyike. Bár a melatonin pontos hatásmechanizmusa még mindig nem ismert, egyre több bizonyíték van arra, hogy a melatonerg és a GABAerg rendszer között szinergia áll fenn. Arról számoltak be, hogy a melatonin adagolása a GABA koncentráció jelentős, dózisfüggő növekedésével jár a központi idegrendszerben . Megfigyeltük, hogy a melatonin hozzáadott dózisa alprazolammal kombinálva hasonló mértékű szedációt okozott, mint az alprazolam önmagában, ami arra utal, hogy az általunk alkalmazott dózisokban a melatonin nem rontotta a szedációs szintet.

A benzodiazepinek a jelentések szerint rontják a pszichomotoros teljesítményt . A melatonin időre és helyre vonatkozó tájékozódási pontszámra gyakorolt hatásáról szóló jelentések eltérőek a szakirodalomban . Mivel a mi betegeinknél csak az időhöz és a helyhez viszonyított tájékozódási pontszámot vettük fel, az a vizsgálat perioperatív időszakában is megmaradt.

Más tanulmányok arról számoltak be, hogy a melatoninnak nincs antegrád amnéziája . A melatonint kapó betegeinknél az amnézia előfordulása alacsony volt, és a placebóhoz hasonló. Az alprazolam 0,5 mg-os és magasabb dózisokban a jelentések szerint károsítja az azonnali és késleltetett emlékezést és felismerést . A melatonin hozzáadása az alprazolámhoz nem változtatta meg az amnéziás hatást betegeinknél.

Érdekes módon a melatonin és az alprazolám kombinációjával premedikált betegeink többsége kifejezte azt az óhaját, hogy a jövőben is hasonló premedikációt kapjon. A benzodiazepinek alvás közbeni ébredési epizódokkal járnak, és később másnapossági hatásokat is mutatnak, mivel csökkentik a gyors szemmozgás és a lassú hullámú alvás időtartamát . Ezzel szemben a melatoninról ismert, hogy javítja az alvás minőségét . Míg a benzodiazepinek a jelentések szerint csökkentik a melatoninszintet , a kombinált gyógyszer valószínűleg javította az alvás minőségét a műtét előtti időszakban, hogy a betegek jobban kedveljék a kombinált premedikációt, mint bármelyik gyógyszer önmagában vagy a placebo. Mivel azonban vizsgálatunkat nem arra terveztük, hogy megvizsgáljuk a kombinált gyógyszeres kezelés preferálásának pontos okát, például a jobb anxiolízis vagy alvás vagy mindkettő, nem tudunk erről bővebben nyilatkozni.

Az általunk használt gyógyszerek mindegyike biztonságos volt a tapasztalt mellékhatások tekintetében. A kisebb problémák, amelyekre betegeink panaszkodtak, a fejfájás, nyugtalanság, szédülés, hányinger és hányás voltak, és ezek gyakorisága minden vizsgálati csoport betegeinél hasonló volt. Vizsgálatunk azonban statisztikailag nem volt elégséges a nemkívánatos események előfordulásának kimutatására. Mind a melatonint, mind az alprazolámot biztonságosnak tartják, és a terápiás tartományban eddig nem dokumentáltak súlyos nemkívánatos hatásokat.

A vizsgálatunk korlátai közé tartozik a két premedikáns gyógyszer faktoriális vizsgálatát tekintve kis mintanagyság, valamint a részletes pszichomotoros és memóriatesztek helyett a tájékozódási pontszám és a késleltetett vizuális epizodikus memória korlátozott tesztelése. Továbbá a vizsgált gyógyszerek vérszintjét sem tudtuk megmérni, mert nem állt módunkban.

5. Következtetés

Míg a melatonin-alprazolám kombináció jobban csökkentette a szorongást, mint bármelyik gyógyszer önmagában, hasonló mértékű szedációt és amnéziát okozott, mint az alprazolám önmagában. Több beteg kívánta a jövőben a melatonin és alprazolám kombinációját premedikánsként kapni. A szerzők az alprazolam és melatonin kombinációjának szájon át történő alkalmazását javasolják premedikánsként sebészeti betegeknél.

Érdekellentét

A szerzők kijelentik, hogy nincs érdekellentét a cikk publikálásával kapcsolatban.

Köszönet

A vizsgálatot a B. P. Koirala Institute of Health Science (BPKIHS), Dharan, Nepál kutatási támogatásával végezték.