Holmes var medaljör i PGA Tour Qualifying Tournament 2005. Han kom på en delad tionde plats i sin första start på PGA Tour vid Sony Open på Hawaii 2006 och i februari samma år vann han FBR Open, vilket gjorde honom till den snabbaste golfaren att nå 1 000 000 dollar i karriärintäkter på PGA Tour. Det var hans femte turnering som proffs och hans fjärde på PGA Tour.

Efter denna seger sjönk hans form, och detta fortsatte under 2007 då han endast gjorde två topp tio placeringar och slutade året på 118:e plats på penninglistan.

Den 3 februari 2008 vann Holmes FBR Open för den andra Tour-segern i sin karriär och erövrade även turneringstiteln för andra gången på tre år. Han inledde den sista rundan med en ledning på fyra slag och på den 18:e tee var han ett slag bakom Phil Mickelson. Holmes gjorde en birdied på det 18:e hålet för att tvinga fram ett slutspel och besegrade sedan Mickelson på det första hålet i slutspelet (det 18:e hålet) genom att göra en sexfots birdieputt efter en 359 meter lång drive. Segern förde Holmes upp på 62:a plats i den officiella världsrankningen för golfspelare. År 2008 nådde Holmes karriärens högsta 42:a plats i OWGR.

Spelstil

Holmes, tillsammans med andra rookies från 2006 som Camilo Villegas och Bubba Watson, är känd för att slå bollen långa sträckor, över 300 meter (312,7 meter, vilket placerar honom som nummer 2 i driving distans, endast 6 meter bakom ledaren Watson). Därför spelar han banor genom att rutinmässigt slå sin driver så långt han kan, vilket påminner om John Dalys ”Grip it and Rip It”-filosofi, och använder sin distansfördel för att komma närmare greenen och i position för en wedge eller ett kort järn till greenen. Även om spelstilen inte är ny har många kritiker klagat över att J.B. Holmes stil har inlett en ny våg av golfspelare som ägnar sig åt att slå bollen så långt de kan, med hjälp av den nyare golfutrustningen som erbjuds av golfklubbsbolagen, och att slå bollen från rough till green, vilket i praktiken eliminerar den utjämnande effekt som golfsporten vanligtvis ger kortare, precisa slagare.

2008 Ryder Cup

I Ryder Cup 2008 besegrade Holmes Europas Søren Hansen med 2&1 under söndagens singelmatcher för att föra USA inom en poäng från att vinna Ryder Cup. Jim Furyk skulle senare besegra Miguel Ángel Jiménez på det 17:e hålet för att vinna Ryder Cup. Holmes och en annan lagkamrat i Ryder Cup, Kenny Perry, utsågs till Årets Kentuckianer 2008 av tidningen Kentucky Monthly.

Hjärnoperation

Efter att ha skjutit en 80:a i den första rundan drog sig Holmes tillbaka från PGA Championship 2011 i augusti. Han hade haft yrsel i flera månader och fick så småningom diagnosen strukturella defekter i lillhjärnan, så kallade Chiari-missbildningar. Han genomgick en hjärnoperation den 1 september 2011, och ungefär en månad senare upptäckte läkarna att Holmes var allergisk mot det lim som användes på den vävformade titanplattan vid basen av hans skalle. Han flögs från sitt hem i Kentucky till Johns Hopkins i Baltimore för ytterligare en operation. Holmes återvände till PGA Tour i slutet av januari 2012 i Farmers Insurance Open.

2012-15: Återhämtning och comeback

Efter hjärnoperationen spelade Holmes i 26 tävlingar under 2012. Skador i armbåge och fotled begränsade honom till sex PGA Tour-tävlingar 2013 och han spelade inte igen förrän i Dunlop Phoenix Tournament på Japan Golf Tour. Holmes uppfyllde sin medicinska förlängning genom inkomster vid 2014 års Zurich Classic of New Orleans och slutade T11. Han skulle behöva ett T63 i Wells Fargo Championship för att få tillträde till Players Championship 2014 via FedEx Cup-poäng. Holmes skulle få sin första seger på sex år, återfick sin Tourstatus genom säsongen 2015-2016 och flyttade från 242:a till 68:e plats i den officiella World Golf Ranking. Segern gav också Holmes inträde till 2014 års PGA Championship på Valhalla Golf Club i Louisville, Kentucky.

I februari 2015 förlorade Holmes i ett sudden-death playoff med fyra spelare i Farmers Insurance Open. Han hade en delad ledning efter 54-hålsstadiet tillsammans med Harris English, men kunde bara skjuta en jämn par-finalrunda för att komma in i slutspelet. På det första playoffhålet gjorde Holmes en birdie för att gå vidare till det andra playoffhålet med Jason Day, efter att English och Scott Stallings eliminerats med pars. På det andra playoffhålet på par tre flög Holmes över green och kunde inte komma ner i två från den bakre roughen, vilket lämnade Day med två puttar från 15 meter för segern.

I den första rundan av WGC-Cadillac Championship slog Holmes en 62:a för en total på 10 under par och ledde med fyra slag efter första dagen. Hans runda innehöll åtta birdies och en eagle för att nå turneringsrekordet. Holmes behöll sin ledning efter den andra rundan, trots att han spelade en över par 73. Han ledde med två slag inför helgen och öppnade en ledning på fem slag efter en 70-rond i den tredje rundan, som inkluderade ett hole-in-one på par-3 fjärde hålet. Hans ledning hade dock försvunnit vid det sjätte hålet i den sista rundan, efter att han hade gjort tre bogeys på de sex första hålen. Holmes spelade resten av sin runda i jämn par och skulle fortsätta att spela en 75:e runda och slutade en bakom vinnaren Dustin Johnson. Andraplatsen flyttade Holmes till 19:e plats på världsrankingen, hans högsta placering hittills.

2018

I januari 2018 kritiserades Holmes av sina proffskamrater på sociala medier efter att ha tagit fyra minuter och tio sekunder på sig över sitt andra slag till det 18:e hålet i den avslutande rundan av Farmers Insurance Open. Holmes behövde en eagle för att komma in i ett slutspel men lade sig till slut. Holmes sade senare att han var ”chockad” av den negativa reaktionen på händelsen, kommentarer som utlöste ytterligare en motreaktion. Proffskollegan Justin Thomas försvarade dock Holmes och sa att han skulle ha gjort exakt samma sak om han hade varit i hans situation.

2019

Den 17 februari 2019 vann Holmes Genesis Open, hans femte seger på PGA Touren och den första på nästan fyra år. Holmes övervann ett underläge på fyra slag i den sista rundan och slutade ett slag före 54-hålsledaren Justin Thomas, i slutet av en maratonartad 34-håls sista dag. Det avgörande ögonblicket inträffade på det 13:e hålet under den sista rundan, då Holmes slog en 12-fots parputt och Thomas missade två korta puttar, vilket resulterade i en dubbelbogey.

Holmes delade ledningen efter 36 hål vid 2019 års Open Championship på Royal Portrush med irländaren Shane Lowry. Holmes spelade öppningsrundor på 66-68 för en total siffra på åtta under. Han kunde dock inte få till det under helgen, utan sköt 69-87 och hamnade på en delad 67:e plats.