Perguntas Frequentes sobre Plasmídeos Lentivirais

Qual é a diferença entre os sistemas lentivirais de 2ª e 3ª geração?

Para uma descrição completa dos lentivírus de 2ª e 3ª geração, por favor reveja a 2ª vs 3ª geração acima. Em resumo, os sistemas lentivíricos de 2ª geração usam mais proteínas HIV (em menos plasmídeos) a fim de produzir partículas lentivíricas funcionais do que os sistemas de 3ª geração.

• 2ª geração de sistemas de embalagem: expressam os genes HIV gag, pol, rev, e tat, todos a partir de um único plasmídeo de embalagem como psPAX2.
• 3ª geração de sistemas de embalagem: express gag e pol de um plasmídeo de embalagem e rev de outro, como pMDLg/pRRE e pRSV-Rev. Os sistemas lentivíricos de terceira geração são considerados mais seguros que os sistemas de segunda geração, mas podem ser mais difíceis de usar porque requerem transferência com quatro plasmídeos separados para criar partículas lentivíricas funcionais.

IMPORTANTE : Um plasmídeo de transferência de terceira geração pode ser usado com um sistema de embalagem de segunda geração, mas um plasmídeo de transferência de segunda geração não pode ser usado com um sistema de embalagem de terceira geração.

Qual é a diferença entre um lentivírus e um retrovírus?

Lentivírus são um subtipo de retrovírus. Do ponto de vista experimental, a principal diferença entre lentivírus e retrovírus padrão (γ-retrovírus) é que os lentivírus são capazes de infectar tipos de células não-divididas e activas, enquanto que os retrovírus padrão só podem infectar tipos de células mitologicamente activas. Isto significa que os lentivírus podem infectar uma maior variedade de tipos de células do que os retrovírus.

Tanto os lentivírus como os retrovírus padrão usam os genes gag, pol, e env para embalagem; no entanto, são vírus diferentes e, portanto, usam isoformas ligeiramente diferentes destes componentes de embalagem. Portanto, os lentivírus podem não ser eficientemente embalados por sistemas de embalagem retrovirais, e vice-versa.

Que estirpe bacteriana deve ser usada para clonar e produzir os meus plasmídeos lentivíricos?

Devido às longas repetições terminais encontradas nos plasmídeos lentivíricos, recomendamos o uso de uma estirpe que reduza a frequência de recombinação homóloga de regiões instáveis, tais como Invitrogen Stbl3™ ou NEB Stable cells. Isto garantirá que as repetições serão mantidas e muitas vezes resulta em um maior rendimento de DNA. No entanto, se o plasmídeo contiver um cassete Gateway contendo o gene ccdB, é necessária uma estirpe de sobrevivência ccdB.

Que linha de células deve ser usada para produzir lentivírus?

293T células são normalmente usadas para produzir lentivírus. A linha de células de 293T pode ser obtida do GenHunter.

O que dita a gama de células do hospedeiro lentiviral (tropismo)?

O tropismo lentiviral é determinado pela capacidade da proteína do envelope viral de interagir com os receptores na superfície da célula hospedeira. A proteína de envelope VSV-G é comumente usada na produção de partículas lentivíricas porque ela confere amplo tropismo sobre uma gama de espécies e tipos de células. Para mais informações, veja o artigo Cronin, et al. sobre diferentes envelopes e seu tropismo.

Como lentivírus pode ser usado para fazer linhas celulares estáveis?

Lentivírus pode ser usado para fazer linhas celulares estáveis da mesma maneira que os retrovírus padrão. Ou seja, muitos genomas lentivíricos têm marcadores selecionáveis, como o gene de resistência à puroamicina, conferindo resistência antibiótica às células hospedeiras infectadas. Quando estes antibióticos são adicionados ao meio de crescimento das células hospedeiras, matam quaisquer células que não tenham incorporado o genoma lentiviral e as células que sobrevivem podem ser expandidas para criar linhas celulares estáveis, que incorporaram o genoma lentiviral e abrigam a informação genética codificada por esse genoma.

Muitos plasmídeos de transferência lentiviral não possuem marcadores selecionáveis que conferem resistência a um antibiótico, mas codificam outro marcador, como o GFP. Um pesquisador pode usar FACS para classificar células que expressam GFP e mais tarde expandir essas células em uma linha celular.

Onde é que os lentivírus se integram?

Estudos genómicos de integração viral mostraram que os lentivírus se integram mais frequentemente em genes transcritos activamente, e que esta preferência é conservada em todas as espécies alvo. Embora a disponibilidade de cromatina facilite a integração, ela não explica a preferência lentiviral por genes transcritos. Estudos comparando o HIV lentivírus e o MMLV retrovírus indicam que a integrase viral desempenha um papel na formação das preferências do local de integração. Um dos principais determinantes celulares é o LEDGF/p75, uma proteína de ligação lentiviral que recruta o complexo de pré-integração para unidades transcripcionais e facilita a integração. Os sítios de ligação LEDGF/p75 são enriquecidos em corpos genéticos e na sua maioria ausentes em promotores e regiões intergênicas, espelhando padrões de integração lentiviral.

Pode plasmídeos lentivíricos ser usados em transfecções directas em vez de fazer vírus?

Alguns (mas não todos) plasmídeos de transferência lentiviral podem ser usados em transfecções transitórias para alcançar a expressão do transgene, e aqueles que podem ser principalmente construções de terceira geração. Os plasmídeos de transferência lentiviral não são projetados especificamente para transfecções transitórias. Portanto, a expressão do transgene pode ser limitada devido aos LTRs lentivíricos. Embora possível, não é explicitamente recomendado o uso de plasmídeos de transferência lentiviral para transfecções simples.

É viável expressar cDNA de um plasmídeo de transferência lentiviral normalmente usado para a expressão de shRNA?

Sim, é viável, mas primeiro o promotor dentro do plasmídeo de transferência deve ser modificado. A maioria dos plasmídeos de shRNA-expressão lentiviral, como o pLKO.1, usa um promotor U6 ou H1 para conduzir a transcrição RNA pol III de shRNAs. A expressão cDNA requer RNA pol II, e portanto requer um promotor RNA pol II, como CMV ou RSV.

Que técnicas podem ser usadas para clonar um inserto num plasmídeo lentiviral contendo apenas um local de restrição?

Se um plasmídeo de transferência lentiviral contiver um único local de restrição, pode-se usar técnicas de clonagem padrão para ligar o inserto neste local. Se não for imediatamente possível digerir e clonar a inserção a partir de um vector parental, algumas abordagens possíveis para usar este site incluem a subclonagem ou a anexação de sites de restrição compatíveis na inserção de interesse usando PCR. O processo de subclonagem consiste em digerir a inserção de interesse a partir do seu vector pai e ligá-la a um segundo vector de forma a que a inserção possa ser posteriormente digerida a partir deste novo vector e clonada no vector lentiviral. Isto é basicamente baralhar os sítios de restrição entre os vetores até que o gene de interesse seja flanqueado por sítios compatíveis com aqueles do vetor nos quais se deseja ligar a inserção. Muitas vezes é menos demorado e mais fácil simplesmente adicionar locais de restrição ao inserto de interesse usando PCR. Isto é conseguido através da amplificação da sequência de inserção por PCR usando iniciadores que contêm os sítios de restrição necessários. Os locais de restrição funcionais devem ser um certo número de bases a partir das extremidades dos primers utilizados. Alternativamente, pode ligar um local de clonagem múltipla (MCS) a partir de um vector separado para o local único no vector lentiviral e gerar locais de restrição mais úteis.

Para mais informações sobre clonagem e alteração de um MCS, visite Addgene’s Plasmid Reference and Protocol Guide.

Como posso clonar o meu insert num vector de transferência sem locais de restrição viáveis mas compatíveis com o sistema de clonagem Gateway®?

Os vectores compatíveis com Gateway® utilizam a recombinação para gerar clones contendo o insert de interesse. Em resumo, o insert é primeiro clonado num vector de entrada numa região ladeada por sequências (chamadas attP1 e attP2) que permitem ao insert recombinar com o vector de destino (neste caso, o vector de destino seria o vector de transferência lentiviral). O vetor de destino contém seqüências attB com as quais as seqüências attP recombinam. Visite o website da Invitrogen para obter mais informações sobre o sistema de clonagem Gateway®.

Que preocupações de segurança envolvem o uso de vectores lentivíricos?

Como referido pelo NIH, as duas principais preocupações de segurança que envolvem o uso de lentivíricos são:

1. O potencial de geração de lentivírus competente de replicação
2. O potencial de oncogénese

O potencial de geração de lentivírus competente de replicação é abordado pelo design dos vectores e pela prática laboratorial segura. Em termos de desenho vectorial, os sistemas lentivíricos de 2ª e 3ª geração fornecidos pela Addgene separam a transferência, envelope e componentes de embalagem do vírus em diferentes vectores. O vector de transferência codifica o gene de interesse e contém as sequências que irão incorporar no genoma da célula hospedeira, mas não pode produzir partículas virais funcionais sem os genes codificados nos vectores de envelope e embalagem. A menos que ocorra recombinação entre o empacotamento, envelope e vetores de transferência, e a construção resultante seja empacotada em uma partícula viral, não é possível que vírus normalmente produzidos a partir destes sistemas se reproduzam e produzam mais vírus após a infecção inicial. A este respeito, os sistemas de terceira geração são considerados mais seguros do que os sistemas de segunda geração porque o vetor de embalagem foi dividido em dois plasmídeos separados (resultando em um sistema de quatro plasmídeos no total). Além disso, os sistemas de 3ª geração não utilizam a tatuagem da proteína HIV para produzir o vírus de comprimento total a partir do vector de transferência durante a fase de produção viral.

Muitos dos vectores de transferência lentiviral que foram depositados com Addgene são vectores auto-inactivadores (SIN). Estes vectores têm uma eliminação no 3’LTR do genoma viral que é transferido para o 5’LTR após uma ronda de transcrição reversa. Esta eliminação elimina a transcrição do vírus completo depois de este ter sido incorporado numa célula hospedeira.

O potencial para oncogénese é largamente baseado na inserção específica contida no vector de transferência lentiviral (dependendo se é ou não um oncogene) e deve ser considerado caso a caso.

A biossegurança deve ser sempre considerada com respeito à natureza precisa das experiências que estão sendo realizadas, e seu escritório de biossegurança pode fornecer mais informações sobre as melhores práticas de sua instituição com relação à pesquisa lentiviral. O NIH tem informações adicionais sobre considerações de segurança lentiviral.