Frequently Asked Questions (FAQ) about Lentiviral Plasmids

Vad är skillnaden mellan 2:a och 3:e generationens lentivirala system?

För en fullständig beskrivning av 2:a och 3:e generationens lentivirussystem, se 2:a vs 3:e generation ovan. Kortfattat använder andra generationens lentivirala system fler hivproteiner (på färre plasmider) för att producera funktionella lentivirala partiklar än tredje generationens system.

• 2:a generationens paketeringssystem: uttrycker hiv:s gag-, pol-, rev- och tatgener från en enda paketeringsplasmid, t.ex. psPAX2.
• 3:e generationens paketeringssystem: uttrycker gag och pol från en paketeringsplasmid och rev från en annan, t.ex. pMDLg/pRRE och pRSV-Rev. Tredje generationens paketeringssystem uttrycker INTE tat. Tredje generationens lentivirala system anses säkrare än andra generationens system, men kan vara svårare att använda eftersom de kräver transfektion med fyra separata plasmider för att skapa funktionella lentivirala partiklar.

VIKTIGT : En 3:e generationens överföringsplasmid kan användas med ett 2:a generationens paketeringssystem, men en 2:a generationens överföringsplasmid kan inte användas med ett 3:e generationens paketeringssystem.

Vad är skillnaden mellan lentivirus och retrovirus?

Lentivirus är en subtyp av retrovirus. Ur experimentell synvinkel är den viktigaste skillnaden mellan lentivirus och standardretrovirus (γ-retrovirus) att lentivirus kan infektera icke-delande och aktivt delande celltyper medan standardretrovirus endast kan infektera mitotiskt aktiva celltyper. Detta innebär att lentivirus kan infektera en större mängd olika celltyper än retrovirus.

Både lentivirus och standardretrovirus använder gag-, pol- och env-generna för paketering, men de är olika virus och använder därför något olika isoformer av dessa paketeringskomponenter. Därför är det möjligt att lentivirus inte kan paketeras effektivt av retrovirala paketeringssystem och vice versa.

Vilken bakteriestam bör användas för kloning och produktion av mina lentivirala plasmider?

På grund av de långa terminala upprepningar som finns i lentivirala plasmider rekommenderar vi att man använder en stam som minskar frekvensen av homolog rekombination av instabila regioner, till exempel Invitrogen Stbl3™ eller NEB Stable cells. Detta säkerställer att upprepningarna bibehålls och resulterar ofta i ett större utbyte av DNA. Om plasmidet innehåller en Gateway-kassett som innehåller ccdB-genen är det dock nödvändigt med en ccdB-överlevnadsstam.

Vilken cellinje bör användas för att producera lentivirus?

293T-celler används vanligtvis för att producera lentivirus. Cellinjen 293T kan erhållas från GenHunter.

Vad dikterar lentivirusets värdcellsräckvidd (tropism)?

Lentivirusets tropism bestäms av förmågan hos det virala höljeproteinet att interagera med receptorer på värdcellens yta. VSV-G-höljeproteinet används vanligen vid produktion av lentivirala partiklar eftersom det ger en bred tropism över en rad arter och celltyper. Mer information finns i artikeln av Cronin, et al. om olika kuvert och deras tropism.

Hur kan lentivirus användas för att framställa stabila cellinjer?

Lentivirus kan användas för att framställa stabila cellinjer på samma sätt som vanliga retrovirus. Det vill säga, många lentivirala genomer har selekterbara markörer, t.ex. puromycinresistensgenen, som ger antibiotikaresistens till infekterade värdceller. När dessa antibiotika tillsätts till värdcellernas tillväxtmedium dödar de alla celler som inte har införlivat det lentivirala genomet, och de celler som överlever kan expanderas för att skapa stabila cellinjer som har införlivat det lentivirala genomet och som innehåller den genetiska information som kodas av detta genom.

Många lentivirala överföringsplasmider har inga selekterbara markörer som ger resistens mot ett antibiotikum, men kodar för en annan markör, till exempel GFP. En forskare kan använda FACS för att sortera celler som uttrycker GFP och senare expandera dessa celler till en cellinje.

Var integreras lentivirus?

Studier av virusintegration över hela genomet har visat att lentivirus oftast integreras i aktivt transkriberade gener, och att denna preferens är bevarad bland målarter. Även om kromatintillgänglighet underlättar integrationen förklarar det inte lentivirernas preferens för transkriberade gener. Studier som jämför lentiviruset HIV och retroviruset MMLV visar att den virala integrase spelar en roll när det gäller att forma preferenser för integrationsställen. En viktig cellulär bestämningsfaktor är LEDGF/p75, ett lentiviralt tetheringsprotein som rekryterar preintegrationskomplexet till transkriptionsenheter och underlättar integrationen. LEDGF/p75-bindningsställen är berikade i genkroppar och saknas mestadels i promotorer och intergeniska regioner, vilket speglar mönstren för lentiviral integration.

Kan lentivirala plasmider användas i direkta transfektioner i stället för att göra virus?

Vissa (men inte alla) lentivirala överföringsplasmider kan användas i transienta transfektioner för att åstadkomma uttryck av transgenen, och de som kan det är främst tredje generationens konstruktioner. Lentivirala överföringsplasmider är inte särskilt utformade för transienta transfektioner. Därför kan transgenuttrycket vara begränsat på grund av de lentivirala LTR:erna. Även om det är möjligt är det inte uttryckligen rekommenderat att använda lentivirala överföringsplasmider för enkla transfektioner.

Är det möjligt att uttrycka cDNA från en lentiviral överföringsplasmid som normalt används för shRNA-uttryck?

Ja, det är möjligt, men först måste promotorn i överföringsplasmiden modifieras. De flesta lentivirala plasmider som uttrycker shRNA, t.ex. pLKO.1, använder en U6- eller H1-promotor för att driva RNA pol III-styrd transkription av shRNA. cDNA-uttryck kräver RNA pol II och därmed en RNA pol II-promotor, t.ex. CMV eller RSV.

Vilka tekniker kan användas för att klona in ett insert i en lentiviral plasmid som endast innehåller en restriktionsplats?

Om en lentiviral överföringsplasmid innehåller en enda restriktionsplats kan man använda vanliga kloningstekniker för att ligera in insertet till denna plats. Om det inte är omedelbart möjligt att smälta och klona insatsen från en föräldravektor, kan man använda denna plats genom subkloning eller genom att lägga till kompatibla restriktionsställen på insatsen av intresse med hjälp av PCR. Subkloneringsprocessen består i att man smälter det intressanta inslaget från dess huvudvektor och ligerar det till en andra vektor på ett sådant sätt att inslaget senare kan smältas från den nya vektorn och klonas in i den lentivirala vektorn. Detta innebär i princip att man blandar restriktionsställen mellan vektorerna tills den aktuella genen flankeras av ställen som är kompatibla med de ställen som finns i den vektor i vilken man slutligen vill ligera in insatsen. Ofta är det mindre tidskrävande och enklare att helt enkelt lägga till restriktionsställen på den aktuella insatsen med hjälp av PCR. Detta sker genom PCR-amplifiering av insättningssekvensen med hjälp av primers som innehåller de restriktionsställen som behövs. De funktionella restriktionsplatserna måste ligga ett visst antal baser från ändarna av de primers som används. Alternativt kan man ligera en multipel kloneringsplats (MCS) från en separat vektor till den enda platsen i den lentivirala vektorn och generera fler användbara restriktionsplatser.

Mer information om kloning och ändring av en MCS finns i Addgene’s Plasmid Reference and Protocol Guide.

Hur klonar jag min insert till en överföringsvektor utan livskraftiga restriktionsställen men som är kompatibel med kloningssystemet Gateway®?

Gateway®-kompatibla vektorer använder rekombination för att generera kloner som innehåller insatsen av intresse. I korthet klonas insatsen först in i en inmatningsvektor i en region som flankeras av sekvenser (kallade attP1 och attP2) som gör det möjligt för insatsen att rekombineras med destinationsvektorn (i det här fallet skulle destinationsvektorn vara den lentivirala överföringsvektorn). Destinationsvektorn innehåller attB-sekvenser med vilka attP-sekvenserna rekombinerar. Besök Invitrogens webbplats för mer information om kloningssystemet Gateway®.

Vilka säkerhetsproblem finns kring användningen av lentivirala vektorer?

Enligt NIH är de två huvudsakliga säkerhetsproblemen kring användningen av lentivirala vektorer följande:

1. Potentialen för generering av replikationskompetenta lentivirus
2. Potentialen för onkogenes

Potentialen för generering av replikationskompetenta lentivirus åtgärdas genom vektorernas utformning och genom säker laboratoriepraxis. När det gäller utformning av vektorer separerar andra och tredje generationens lentivirala system som tillhandahålls av Addgene virusets överförings-, kuvert- och förpackningskomponenter på olika vektorer. Överföringsvektorn kodar för den aktuella genen och innehåller de sekvenser som kommer att införlivas i värdcellens arvsmassa, men kan inte producera funktionella viruspartiklar utan de gener som kodas i kuvert- och förpackningsvektorerna. Om inte rekombination sker mellan förpacknings-, hölje- och överföringsvektorerna och den resulterande konstruktionen paketeras till en viruspartikel, är det inte möjligt för virus som normalt produceras från dessa system att replikera och producera mer virus efter den första infektionen. I detta avseende anses tredje generationens system vara säkrare än andra generationens system eftersom förpackningsvektorn har delats upp i två separata plasmider (vilket resulterar i ett system med totalt fyra plasmider). Dessutom använder tredje generationens system inte hivproteinet tat för att producera virus i full längd från överföringsvektorn under virusproduktionsfasen.

Många av de lentivirala överföringsvektorer som har deponerats hos Addgene är självaktiverande (SIN) vektorer. Dessa vektorer har en deletion i 3’LTR av virusgenomet som överförs till 5’LTR efter en omvänd transkription. Denna deletion upphäver transkriptionen av det fullständiga viruset efter att det har införlivats i en värdcell.

Potentialen för onkogenes är till stor del baserad på det specifika inslaget i den lentivirala överföringsvektorn (beroende på om det är en onkogen eller inte) och bör övervägas från fall till fall.

Biosäkerhet bör alltid övervägas med hänsyn till den exakta karaktären på de experiment som utförs, och ditt biosäkerhetskontor kan ge mer information om din institutions bästa praxis när det gäller lentiviral forskning. NIH har ytterligare information om säkerhetsöverväganden i samband med lentiviralforskning.