Resultados e Discussão

Caspase-3 e Caspase-7 Exibem Atividade Diferencial em Relação a Substratos Sintéticos.

Caspase-3 e caspase-7 são ambas ativadas universalmente durante a apoptose, independentemente do estímulo específico de iniciação da morte, e ambas as proteases são amplamente consideradas para coordenar a fase de demolição da apoptose através da clivagem de um conjunto diverso de substratos proteicos (1, 2). No entanto, a contribuição relativa destas proteases para a demolição celular permanece largamente especulativa. As caspase-3 e caspase-7 estão mais intimamente relacionadas entre si, em comparação com outras caspas de mamíferos, mas ainda assim apresentam uma divergência substancial de sequência, com uma identidade de sequência global de 56% e semelhança de sequência de 73% (Fig. 1A). Para explorar mais detalhadamente as preferências de substrato destas caspases, expressamos ambas as enzimas como proteínas marcadas por His em bactérias e as purificamos para homogeneidade (Fig. 1B). Ambas as caspases foram ativadas contra DEVD-AFC em combinação com o inibidor de polycaspase zVAD-fmk (Fig. 1C). Com base nos dados de titulação do local ativo, a concentração ativa de cada enzima foi normalizada para permitir comparações diretas entre essas enzimas em experimentos subseqüentes (Fig. 1D). Comparamos então estas caspases em termos da sua capacidade de hidrolisar um painel de substratos de tetrapéptidos sintéticos. Como ilustra a Fig. 1E, ambas as caspases são preferencialmente clivadas DEVD-AFC com eficiência essencialmente idêntica. Em contraste, a caspase-3 clivada LEHD-AFC com mais eficiência do que a caspase-7, sugerindo que essas proteases possuem atividades distintas em relação a certos substratos sintéticos (Fig. 1E).