Výsledky a diskuse

Kaspáza-3 a kaspáza-7 vykazují rozdílnou aktivitu vůči syntetickým substrátům.

Kaspáza-3 i kaspáza-7 jsou během apoptózy aktivovány univerzálně, bez ohledu na konkrétní podnět iniciující smrt, a obecně se má za to, že obě proteázy koordinují demoliční fázi apoptózy štěpením rozmanité škály proteinových substrátů (1, 2). Relativní podíl těchto proteáz na buněčné demolici však zůstává do značné míry spekulativní. Kaspáza-3 a kaspáza-7 jsou si ve srovnání s ostatními savčími kaspázami nejblíže příbuzné, ale přesto vykazují značné sekvenční rozdíly, přičemž celková sekvenční identita činí 56 % a sekvenční podobnost 73 % (obr. 1A). Abychom podrobněji prozkoumali substrátové preference těchto kaspáz, exprimovali jsme oba enzymy jako His-značené proteiny v bakteriích a purifikovali je do homogenity (obr. 1B). Obě kaspázy byly testovány na aktivním místě proti DEVD-AFC v kombinaci s inhibitorem polykaspáz zVAD-fmk (obr. 1C). Na základě údajů o titraci aktivního místa byla normalizována aktivní koncentrace každého enzymu, aby bylo možné tyto enzymy v dalších experimentech přímo porovnat (obr. 1D). Poté jsme tyto kaspázy porovnali z hlediska jejich schopnosti hydrolyzovat panel syntetických tetrapeptidových substrátů. Jak ukazuje obr. 1E, obě kaspázy přednostně štěpily DEVD-AFC v podstatě se stejnou účinností. Naproti tomu kaspáza-3 štěpila LEHD-AFC účinněji než kaspáza-7, což naznačuje, že tyto proteázy mají odlišné aktivity vůči určitým syntetickým substrátům (obr. 1E).