Material vegetal

As folhas de Strychnos spinosa Lam. foram coletadas em janeiro de 2013 na aldeia de Sakara, Zaria, Nigéria. O material vegetal foi identificado por Musa Muhammad um botânico da seção de herbário do Departamento de Ciências Biológicas (Universidade Ahmadu Bello, Zaria) onde foi depositado um espécime de voucher (No 900161). As folhas coletadas foram secas em uma sala ventilada livre de contaminação e depois moídas em pó usando um moinho Macsalab (Modelo 2000 LAB Eriez), mantidas em um recipiente de vidro e armazenadas no escuro à temperatura ambiente (25 ± 3°C) antes de serem usadas.

Extração e fracionamento líquido-líquido

Extratos de acetona, metanol e diclorometano/metanol

Uma variação do método de Suficiência & Douros foi usado para fracionar os componentes presentes em diferentes extratos foliares. O pó foliar seco (2 kg) foi macerado três vezes em acetona (6 l) para dar o extrato de acetona (AcetE, 75 g) após a filtração e remoção do solvente em vácuo. Os resíduos foram ainda macerados em metanol (6 l) seguindo o mesmo procedimento descrito acima para a extração da acetona, para dar o extrato de metanol (MetE, 119,2 g). Uma parte das folhas secas em pó (1 kg) também foi extraída em uma mistura (1/1, v/v) de diclorometano/metanol (3 l) três vezes para dar o extrato de diclorometano/metanol (DcmMetE, 114 g) após a filtração e remoção do solvente em vácuo. Uma parte do extrato de acetona (70 g) foi dissolvida e fracionada em uma mistura (1/1, v/v) de clorofórmio e água para produzir as frações de água e clorofórmio. n-butanol foi adicionado à fração água para produzir as frações de n-butanol (nButF, 25,1 g) e água (Wat1, 5 g). A fração de clorofórmio foi concentrada até secar e dissolvida em 10% de água em metanol antes da extração com hexano. A fração de hexano (HexF, 23. 9 g) e o resíduo de 10% de água no metanol foram obtidos após a adição de n-hexano. A proporção de água no metanol foi aumentada para 35% de água no componente metanol que finalmente deu frações de clorofórmio (ChlF, 7,05 g) e 35% de água (wat2, 2,8 g) após a adição de clorofórmio. Do TLC comparativo, as frações de água (Wat1) e 35% de água em metanol (Wat2) foram combinadas em uma fração (WatF, 7,8 g).

Exploração de alcalóides

As folhas de S. spinosa (1 kg) foram maceradas com a mistura (96:3:1, v/v) de EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) e depois percoladas com EtOAc para dar o extrato (26 g) após a remoção do solvente utilizando evaporador rotativo sob pressão reduzida. O extrato foi dissolvido em EtOAc e extraído com 4% de ácido acético para permitir a fração EtOAc (EtAcF, 20,02 g). A solução ácida (pH 3-4) foi basificada para pH (8-9) com Na2CO3 e extraída três vezes com DCM para dar extrato de alcalóides brutos (AlkE, 2,8 g) após a remoção do solvente em vácuo.

Ensaio antimicrobiano

Microorganismos e preparação do inóculo

Microorganismos utilizados foram três bactérias Gram-positivas, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) e Enterococcus faecalis (ATCC 29212), uma bactéria Gram-negativa, Escherichia coli (ATCC 25922); e quatro fungos incluindo três leveduras Candida albicans, Cryptococcus neoformans (isolados de animais) e Candida albicans (ATCC 10231) e um fungo filamentoso Aspergillus fumigatus. Algumas cepas fúngicas utilizadas foram cultivadas a partir de casos clínicos de doenças infecciosas fúngicas em animais, antes do tratamento, no Departamento de Doenças Tropicais Veterinárias da Faculdade de Ciências Veterinárias. C. albicans foi isolado de um tentilhão de Gouldian, C. neoformans de uma chita, enquanto A. fumigatus foi isolado de uma galinha que sofria de uma micose sistêmica.

Culturas bacterianas e fúngicas foram retiradas de placas de cultura de ágar fresco 24 h e inoculadas em caldo de sabouraud dextrose fresco (SDB) para fungos e caldo Mueller-Hinton (MHB) (Fluka, Suíça) para bactérias, antes da realização do ensaio. A turbidez da suspensão microbiana foi ajustada para um padrão McFarland 0,5 equivalente a concentrações de 1-5 × 108 e 1-5 × 107 cfu/ml para bactérias e fungos, respectivamente. As suspensões microbianas foram ainda diluídas (1:100) em meio para obter um inóculo final de aproximadamente 1,5 × 106 cfu/ml para bactérias e 1,5 × 105 cfu/ml para fungos.

Determinação da concentração inibitória de minimun

Um método de microdiluição em série dupla com tetrazolium violet como indicador de crescimento microbiano foi usado para determinar os valores da concentração inibitória mínima (MIC) para extratos e frações contra bactérias e fungos como modificado por Masoko et al. .

A 100 μl (10 mg/ml) de extratos e frações dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) foram diluídos em série duas vezes com água destilada estéril em placas de 96 poços e 100 μl de cultura microbiana recentemente preparada em MHB ou SDB foi adicionado a cada poço. DMSO (5%) foi usado como controle negativo enquanto (1 mg/ml) gentamicina e anfotericina B foram controles positivos. As placas de microtitulação foram seladas em sacos plásticos e incubadas por 24 h a 37°C. Em seguida, 40 μl de 0,2 mg/ml de p-iodonitrotetrazolium violet (INT) foi adicionado a cada poço e as placas de microtítulo foram incubadas a 37°C. As concentrações inibitórias mínimas foram determinadas após 1 e 2 h para as bactérias e 16 e 36 h para os fungos. A MIC foi determinada como a menor concentração inibidora do crescimento microbiano, indicada por uma diminuição da intensidade da cor vermelha do formazan.

Ensaio antioxidante

Atividade antioxidante dos extratos e frações das folhas de S. spinosa foram determinadas em termos de capacidade de limpeza dos radicais livres usando o sal diamônico 2,2′-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e 2,2-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) (ABTS).

EnsaioDPPH

A atividade antioxidante foi realizada como descrito por Du Toit et al. com ligeiras modificações. As amostras foram dissolvidas em metanol para HPLC (Sigma-Aldrich, Alemanha) e diluídas em série duas vezes até as faixas de concentração de 1000 a 7,81 μg/ml para extratos e frações, e 40 a 0,31 μg/ml para um ácido L-ascórbico de referência padrão (Sigma, Alemanha). Em resumo, 40 μl de (10 mg/ml) de amostras foram introduzidas em placas de 96 poços de microtítulo (Bioster, Espanha) e diluídas em série em duas vezes em metanol. Posteriormente, 160 μl de (3,7 mg/100 ml) solução metanólica de 2,2-difenil-1-picri-hidrazil (DPPH) foi introduzida em cada poço e após 30 min de incubação à temperatura ambiente na escuridão e a absorvância foi medida a 517 nm usando um Leitor de Microplacas Multi-Mode (BioTek, EUA). A atividade de limpeza dos radicais livres de cada amostra e o padrão de referência foram determinados como percentagem da inibição obtida da seguinte fórmula:

Com Absample como absorvância do extrato com DPPH, Abblank como absorvância do extrato sem DPPH e Abcontrol como absorvância do metanol e DPPH. A concentração das amostras reduzindo 50% da DPPH de radicais livres (IC50) foi determinada traçando a porcentagem de inibição contra as concentrações da amostra. O ensaio foi replicado três vezes e os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

ensaioABTS

A capacidade de absorção de extratos e frações de ABTS foi determinada usando um método de Re et al. com ligeiras modificações. Em resumo, o radical ABTS foi gerado pela reação de 7 mM de solução de ABTS e 2,45 mM de persulfato de potássio à temperatura ambiente durante 12 h. A absorvância da solução de reserva de radical ABTS foi ajustada para 7,00 ± 0,02 a 734 nm antes de ser utilizada. 40 μl de uma solução de extratos ou frações dissolvidos em metanol grau HPLC (Sigma-Aldrich, Alemanha) foram introduzidos em placas de microtítulo e tow-fold serialmente diluídos na faixa de concentrações de 15,62 e 2000 μg/ml. Trolox (Sigma, Alemanha) e ácido L-ascórbico (Sigma, Alemanha) foram preparados em concentrações que variam de 200 a 1,56 μg/ml. Posteriormente, foram adicionados 160 μl de solução ABTS aos poços (excepto o branco) e a absorvância foi medida a 734 nm após 6 min de incubação à temperatura ambiente. Trolox e ácido ascórbico foram utilizados como controles positivos, metanol como controle negativo e extratos ou frações sem ABTS como branco. A percentagem de inibição do ABTS-+ e IC50 foram calculadas como relatado acima para o ensaio DPPH.

Ensaio de citotoxicidade

A citotoxicidade dos extractos de acetona e fracções contra células de rim de macaco Vero foi avaliada pelo ensaio de redução do MTT como descrito anteriormente com ligeiras modificações. As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 105 células/ml (100 μl) em placas de microtítulo de 96 poços e incubadas a 37°C e 5% de CO2 em ambiente umidificado. Após 24 h de incubação, foram adicionadas amostras (100 μl) em concentrações finais variáveis aos poços contendo células. A doxorubicina foi utilizada como referência positiva. Também foi incluído um controle adequado de branco com concentrações equivalentes de acetona e as placas foram ainda incubadas durante 48 h numa incubadora de CO2. Em seguida, o meio em cada poço foi aspirado das células, que foram então lavadas com PBS, e finalmente o meio fresco (200 μl) foi adicionado a cada poço. Em seguida, 30 μl de MTT (5 mg/ml em PBS) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas a 37°C durante 4 h. O meio foi aspirado dos poços e DMSO foi adicionado para solubilizar os cristais formados de formazan. A absorção foi medida em um leitor de microplacas BioTek Synergy a 570 nm. A inibição do crescimento celular para cada extrato foi expressa em termos de valores de LC50, definidos como a concentração que causou 50% de inibição da viabilidade celular. Os valores do índice de seletividade (SI) foram calculados dividindo os valores de citotoxicidade LC50 pelos valores de MIC (SI = LC50/MIC). Os testes foram realizados em quadruplicata e cada experimento foi repetido três vezes.

Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os valores expressos como média ± desvio padrão. As diferenças entre os valores foram avaliadas para significância usando a análise de variância e os resultados foram comparados usando a diferença menos significativa de Fisher (LSD) a 5% de significância.