Plantenmateriaal

De bladeren van Strychnos spinosa Lam. werden in januari 2013 verzameld in het dorp Sakara, Zaria, Nigeria. Het plantmateriaal werd geïdentificeerd door Musa Muhammad een botanicus van de herbariumsectie van het Department of Biological Sciences (Ahmadu Bello University, Zaria) waar een voucher specimen (No 900161) werd gedeponeerd. De verzamelde bladeren werden gedroogd in een geventileerde ruimte vrij van verontreiniging en vervolgens vermalen tot een poeder met behulp van een Macsalab molen (Model 2000 LAB Eriez), bewaard in een glazen container en bewaard in het donker bij kamertemperatuur (25 ± 3 ° C) vóór gebruik.

Extractie en vloeistof-vloeistof fractionering

Aceton-, methanol- en dichloormethaan/methanolextracties

Een variatie op de methode van Suffness & Douros werd gebruikt om de componenten aanwezig in verschillende bladextracten te fractioneren. Het gedroogde bladpoeder (2 kg) werd driemaal gemacereerd in aceton (6 l) om het acetonextract (AcetE, 75 g) te verkrijgen na filtratie en verwijdering van het oplosmiddel in vacuüm. De residuen werden verder gemacereerd in methanol (6 l) volgens dezelfde procedure als beschreven voor de acetonextractie hierboven, om het methanolextract (MetE, 119,2 g) te verkrijgen. Een deel van de gedroogde verpulverde bladeren (1 kg) werd ook driemaal geëxtraheerd in een mengsel (1/1, v/v) van dichloormethaan/methanol (3 l) om het dichloormethaan/methanolextract (DcmMetE, 114 g) te verkrijgen na filtratie en verwijdering van het oplosmiddel in vacuüm. Een deel van het acetonextract (70 g) werd opgelost en gefractioneerd in een mengsel (1/1, v/v) van chloroform en water om de water- en chloroformfracties te verkrijgen. n-Butanol werd toegevoegd aan de waterfractie om de n-butanolfractie (nButF, 25,1 g) en de waterfractie (Wat1, 5 g) te verkrijgen. De chloroformfractie werd tot droogte geconcentreerd en opgelost in 10% water in methanol vóór de extractie met hexaan. De hexaanfractie (HexF, 23,9 g) en het residu van 10% water in methanol werden aldus verkregen na toevoeging van n-hexaan. Het aandeel water in methanol werd verhoogd tot een 35% water in methanol-component die uiteindelijk chloroform- (ChlF, 7,05 g) en 35% water- (wat2, 2,8 g) fracties opleverde na toevoeging van chloroform. Uit de vergelijkende TLC werden water (Wat1) en 35% water in methanol (Wat2) fracties samengevoegd tot één fractie (WatF, 7,8 g).

Alkaloïden extractie

De bladeren van S. spinosa (1 kg) werden gemacereerd met het mengsel (96:3:1, v/v) van EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) en vervolgens gepercoleerd met EtOAc om het extract (26 g) te verkrijgen na verwijdering van het oplosmiddel met een rotatieverdamper onder verminderde druk. Het extract werd opgelost in EtOAc en geëxtraheerd met 4% azijnzuur om de EtOAc-fractie (EtAcF, 20,02 g) te verkrijgen. De zure oplossing (pH 3-4) werd met Na2CO3 tot pH (8-9) gebaseeerd en driemaal met DCM geëxtraheerd om ruw alkaloïdenextract (AlkE, 2,8 g) te verkrijgen na verwijdering van het oplosmiddel in vacuüm.

Antimicrobiële test

Micro-organismen en inoculumbereiding

Micro-organismen die werden gebruikt, waren drie Gram-positieve bacteriën, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) en Enterococcus faecalis (ATCC 29212), één Gram-negatieve bacterie, Escherichia coli (ATCC 25922); en vier schimmels waaronder drie gisten, Candida albicans, Cryptococcus neoformans (dierlijke isolaten) en Candida albicans (ATCC 10231) en één filamenteuze schimmel, Aspergillus fumigatus. Sommige gebruikte schimmelstammen werden gekweekt uit klinische gevallen van schimmelinfectieziekten bij dieren, vóór behandeling, op de afdeling Veterinaire Tropische Ziekten, Faculteit Diergeneeskunde. C. albicans werd geïsoleerd uit een Gouldian vink, C. neoformans uit een cheetah, terwijl A. fumigatus werd geïsoleerd uit een kip die leed aan een systemische mycose.

Bacteriële en schimmelculturen werden genomen van 24 uur verse agar cultuurplaten en geënt in verse Sabouraud dextrose bouillon (SDB) voor schimmels en Mueller-Hinton bouillon (MHB) (Fluka, Zwitserland) voor bacteriën, voorafgaand aan het uitvoeren van de test. De troebelheid van de microbiële suspensie werd op een McFarland-norm 0,5 gebracht, wat overeenkomt met concentraties van 1-5 × 108 en 1-5 × 107 kve/ml voor respectievelijk bacteriën en schimmels. De microbiële suspensies werden verder verdund (1:100) in media om een uiteindelijk inoculum te verkrijgen van ongeveer 1,5 × 106 kve/ml voor bacteriën en 1,5 × 105 kve/ml voor schimmels.

Minimale remmende concentratiebepaling

Een tweevoudige seriële microdilutiemethode met tetrazoliumviolet als indicator van microbiële groei werd gebruikt om de minimale remmende concentratie (MIC) waarden voor extracten en fracties tegen bacteriën en schimmels te bepalen, zoals gewijzigd door Masoko et al.

Een monster van 100 μl (10 mg/ml) extracten en fracties, opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO), werd in tweevoud serieel verdund met steriel gedestilleerd water in 96-well microtiterplaten en aan elk putje werd 100 μl vers bereide microbiële cultuur in MHB of SDB toegevoegd. DMSO (5%) werd gebruikt als negatieve controle, terwijl (1 mg/ml) gentamicine en amfotericine B als positieve controles werden gebruikt. De microtiterplaten werden in plastic zakken verzegeld en gedurende 24 uur bij 37°C geïncubeerd. Daarna werd aan elk putje 40 μl 0,2 mg/ml p-joodnitrotetrazoliumviolet (INT) toegevoegd en werden de microtiterplaatjes verder geïncubeerd bij 37 °C. Minimale remmende concentraties werden bepaald na 1 en 2 uur voor bacteriën, en 16 en 36 uur voor schimmels. De MIC werd bepaald als de laagste concentratie die de microbiële groei remt, aangegeven door een afname in de intensiteit van de rode kleur van het formazan.

Antioxidant assays

De antioxidant activiteiten van extracten en fracties van de bladeren van S. spinosa werden bepaald in termen van vrije-radicalen-vangvermogen met behulp van 2,2′-difenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) en 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) diammoniumzout (ABTS).

DPPH-assay

De antioxidantactiviteit werd uitgevoerd zoals beschreven door Du Toit et al. met kleine wijzigingen. De monsters werden opgelost in methanol van HPLC-kwaliteit (Sigma-Aldrich, Duitsland) en tweemaal serieel verdund tot concentratiebereiken van 1000 tot 7,81 μg/ml voor extracten en fracties, en 40 tot 0,31 μg/ml voor een standaardreferentie L-ascorbinezuur (Sigma, Duitsland). Kort gezegd werd 40 μl (10 mg/ml) van de monsters in een 96-well microtiterplaat (Bioster, Spanje) gebracht en tweemaal serieel verdund in methanol. Vervolgens werd 160 μl (3,7 mg/100 ml) methanoloplossing van 2,2-difenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) in elk putje gebracht en na 30 min incubatie bij kamertemperatuur in het donker werd de extinctie gemeten bij 517 nm met behulp van een Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA). De vrije-radicalen-wegvangende activiteit van elk monster en de referentiestandaard werd bepaald als percentage van de remming verkregen met de volgende formule:

Met Absample als de extinctie van het extract met DPPH, Abblank als de extinctie van het extract zonder DPPH en Abcontrol als de extinctie van methanol en DPPH. De concentratie van de monsters die 50% van het vrije-radicaal DPPH reduceert (IC50) werd bepaald door het percentage remming uit te zetten tegen de monsterconcentraties. De test werd driemaal herhaald en de resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking.

ABTS assay

Het ABTS-radical-scavenging vermogen van extracten en fracties werd bepaald met behulp van een methode van Re et al. met kleine wijzigingen. Kort gezegd werd het ABTS-radicaal gegenereerd door 7 mM oplossing van ABTS en 2,45 mM oplossing van kaliumpersulfaat bij kamertemperatuur gedurende 12 uur te laten reageren. De absorptie van de voorraadoplossing van ABTS-radicaal werd vóór gebruik op 7,00 ± 0,02 bij 734 nm gebracht. 40 ul van een oplossing van extracten of fracties opgelost in HPLC-kwaliteit methanol (Sigma-Aldrich, Duitsland) werden op microtiterplaten gebracht en in serie verdund tot concentraties tussen 15,62 en 2000 μg/ml. Trolox (Sigma, Duitsland) en L-ascorbinezuur (Sigma, Duitsland) werden bereid in concentraties variërend van 200 tot 1,56 μg/ml. Daarna werd 160 μl ABTS-oplossing toegevoegd aan de putjes (behalve de blanco) en werd de extinctie gemeten bij 734 nm na 6 min incubatie bij kamertemperatuur. Trolox en ascorbinezuur werden gebruikt als positieve controles, methanol als negatieve controle en extracten of fracties zonder ABTS als blanco. Percentage ABTS-+ remming en IC50 werden berekend zoals hierboven gerapporteerd voor DPPH assay.

Cytotoxicity assay

De cytotoxiciteit van de acetonextracten en -fracties tegen Vero-aapniercellen werd beoordeeld met de MTT-reductietest zoals eerder beschreven met kleine modificaties. Cellen werden bij een dichtheid van 1 × 105 cellen/ml (100 μl) gezaaid in 96-well microtiterplaten en geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2 in een vochtige omgeving. Na 24 uur incubatie werden monsters (100 μl) met variërende eindconcentraties toegevoegd aan de putjes die cellen bevatten. Doxorubicine werd als positieve referentie gebruikt. Er werd ook een geschikte blanco controle met gelijkwaardige concentraties aceton toegevoegd en de platen werden verder gedurende 48 uur geïncubeerd in een CO2-incubator. Daarna werd het medium in elk putje afgezogen van de cellen, die vervolgens werden gewassen met PBS, en ten slotte werd vers medium (200 μl) toegevoegd aan elk putje. Vervolgens werd 30 μl MTT (5 mg/ml in PBS) toegevoegd aan elk putje en werden de platen gedurende 4 uur geïncubeerd bij 37°C. Het medium werd uit de putjes geaspireerd en DMSO werd toegevoegd om de gevormde formazankristallen te solubiliseren. De extinctie werd gemeten op een BioTek Synergy microtiterplaatlezer bij 570 nm. De remming van de celgroei voor elk extract werd uitgedrukt in LC50-waarden, gedefinieerd als de concentratie die 50% van de remming van de levensvatbaarheid van de cellen veroorzaakt. De selectiviteitsindex (SI) werd berekend door de cytotoxiciteit LC50-waarden te delen door de MIC-waarden (SI = LC50/MIC). De tests werden in viervoud uitgevoerd en elk experiment werd driemaal herhaald.

Statistische analyse

Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de waarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. Verschillen tussen waarden werden beoordeeld op significantie met behulp van variantieanalyse en de resultaten werden vergeleken met behulp van de Fisher’s least significant difference (LSD) op 5% significantieniveau.