Növényi anyag

The leaves of Strychnos spinosa Lam. bogyóit 2013 januárjában gyűjtötték be a nigériai Sakara faluból, Zariából. A növényi anyagot Musa Muhammad botanikus azonosította a Biológiai Tudományok Tanszék (Ahmadu Bello Egyetem, Zaria) herbáriumi részlegében, ahol egy utalványmintát (No 900161) letétbe helyeztek. A begyűjtött leveleket szellőztetett, szennyeződésektől mentes helyiségben megszárították, majd Macsalab malom (Model 2000 LAB Eriez) segítségével porrá őrölték, üvegedényben tárolták, és felhasználás előtt sötétben, szobahőmérsékleten (25 ± 3°C) tárolták.

Extrakció és folyadék-folyadék frakcionálás

Aceton, metanol és diklórmetán/methanol extrakciók

A Suffness & Douros módszerének variációját használtuk a különböző levélkivonatokban jelen lévő komponensek frakcionálására. A szárított levélport (2 kg) háromszor maceráltuk acetonban (6 l), hogy szűrés és az oldószer vákuumban történő eltávolítása után aceton kivonatot (AcetE, 75 g) kapjunk. A maradékot metanolban (6 l) tovább maceráltuk a fenti acetonos extrakcióval leírt eljárás szerint, így kaptuk a metanolos kivonatot (MetE, 119,2 g). A szárított, porított levelek egy részét (1 kg) szintén háromszor extraháltuk diklórmetán/metanol (3 l) keverékében (1/1, v/v), hogy szűrés és az oldószer vákuumban történő eltávolítása után diklórmetán/metanol kivonatot (DcmMetE, 114 g) kapjunk. Az acetonkivonat egy részét (70 g) feloldottuk és kloroform és víz (1/1, v/v) keverékében frakcionáltuk, így kaptuk a vizes és kloroformos frakciókat. n-butanolt adtunk a vizes frakcióhoz, így kaptuk az n-butanol (nButF, 25,1 g) és a vizes (Wat1, 5 g) frakciókat. A kloroformfrakciót szárazra koncentráltuk és 10%-os vízben metanolban oldottuk fel a hexánnal történő extrakció előtt. A hexánfrakciót (HexF, 23. 9 g) és a 10%-os víz-metanolban lévő maradékot tehát n-hexán hozzáadása után kaptuk. A víz metanolban arányát növeltük, hogy 35% víz metanolban komponenst kapjunk, amely végül kloroform (ChlF, 7,05 g) és 35% víz (wat2, 2,8 g) frakciót adott kloroform hozzáadása után. Az összehasonlító TLC alapján a víz (Wat1) és a 35% víz metanolban (Wat2) frakciókat egy frakcióban (WatF, 7,8 g) egyesítettük.

Alkaloidok kivonása

A S. spinosa leveleit (1 kg) EtOAc-EtOH-NH4OH (96:3:1, v/v) keverékével (600 ml) maceráltuk, majd EtOAc-val perkoláltuk, hogy az oldószer rotációs párologtatóval, csökkentett nyomáson történő eltávolítása után megkapjuk a kivonatot (26 g). A kivonatot EtOAc-ban feloldottuk és 4%-os ecetsavval extraháltuk, hogy EtOAc-frakciót (EtAcF, 20,02 g) kapjunk. A savas oldatot (pH 3-4) Na2CO3-mal pH-ra (8-9) lúgosítottuk, majd háromszor extraháltuk DCM-mel, hogy az oldószer vákuumban történő eltávolítása után nyers alkaloid-kivonatot (AlkE, 2,8 g) kapjunk.

Antimikrobiális vizsgálat

Mikroorganizmusok és inokulumkészítés

A felhasznált mikroorganizmusok három Gram-pozitív baktérium, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) és Enterococcus faecalis (ATCC 29212), egy Gram-negatív baktérium, Escherichia coli (ATCC 25922) voltak; és négy gomba, köztük három élesztőgomba Candida albicans, Cryptococcus neoformans (állati izolátumok) és Candida albicans (ATCC 10231), valamint egy fonalas gomba Aspergillus fumigatus. Néhány felhasznált gombatörzset az Állatorvos-tudományi Kar Állatorvosi Trópusi Betegségek Tanszékén az állatok klinikai fertőzéses gombás megbetegedéseiből tenyésztettek ki a kezelés előtt. A C. albicans-t egy gouldi pintyből, a C. neoformans-t egy gepárdból, míg az A. fumigatus-t egy szisztémás mikózisban szenvedő csirkéből izolálták.

A baktérium- és gombakultúrákat 24 órás friss agar tenyészlemezekről vettük, és a vizsgálat elvégzése előtt friss Sabouraud-dextróz-lébe (SDB) oltottuk a gombák, illetve Mueller-Hinton-lébe (MHB) (Fluka, Svájc) a baktériumok esetében. A mikrobiális szuszpenzió zavarosságát a baktériumok esetében 1-5 × 108, a gombák esetében 1-5 × 107 cfu/ml koncentrációnak megfelelő 0,5-ös McFarland-standardra állítottuk be. A mikrobiális szuszpenziókat tovább hígítottuk (1:100) közegben, hogy a baktériumok esetében körülbelül 1,5 × 106 cfu/ml, a gombák esetében pedig 1,5 × 105 cfu/ml végső inokulumot kapjunk.

Minimális gátló koncentráció meghatározása

A kivonatok és frakciók baktériumokkal és gombákkal szembeni minimális gátló koncentráció (MIC) értékeinek meghatározásához a Masoko et al. által módosított kétszeres sorozatos mikrohígítási módszert alkalmaztuk tetrazoliumviolettel mint a mikrobák növekedésének indikátorával. .

A dimetilszulfoxidban (DMSO) feloldott kivonatok és frakciók 100 μl-jét (10 mg/ml) kétszeresére hígítottuk steril desztillált vízzel 96 lyukú mikrotiterlemezekben, és minden lyukba 100 μl frissen készített mikrobakultúrát adtunk MHB-ben vagy SDB-ben. A DMSO-t (5%) negatív kontrollként használtuk, míg a (1 mg/ml) gentamicin és az amfotericin B pozitív kontrollok voltak. A mikrotiterlemezeket műanyag zacskókba zártuk, és 24 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Ezt követően 40 μl 0,2 mg/ml p-iodonitrotetrazolium-violett (INT) 0,2 mg/ml-t adtunk minden egyes mélyedésbe, és a mikrotiterlemezeket tovább inkubáltuk 37°C-on. A minimális gátló koncentrációkat baktériumok esetében 1 és 2 óra, gombák esetében pedig 16 és 36 óra elteltével határoztuk meg. A MIC-et a mikrobiális növekedést gátló legalacsonyabb koncentrációként határoztuk meg, amit a formazán vörös színének intenzitáscsökkenése jelzett.

Antioxidáns vizsgálatok

A levelek kivonatainak és frakcióinak antioxidáns aktivitása a S. spinosa szabadgyökfogó képességét 2,2′-difenil-1-pikrhidrazil (DPPH) és 2,2-azino-bisz (3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsav) diammóniumsó (ABTS) segítségével határoztuk meg.

DPPH vizsgálat

Az antioxidáns aktivitást a Du Toit et al. által leírtak szerint végeztük, kisebb módosításokkal. A mintákat HPLC-minőségű metanolban (Sigma-Aldrich, Németország) oldottuk fel, és kétszeres sorozatban hígítottuk a kivonatok és frakciók esetében 1000-7,81 μg/ml koncentrációtartományig, a standard referencia L-aszkorbinsav (Sigma, Németország) esetében pedig 40-0,31 μg/ml koncentrációig. Röviden, 40 μl (10 mg/ml) mintát 96 lyukú mikrotiterlemezbe (Bioster, Spanyolország) helyeztünk, és kétszeres sorozatban hígítottuk metanolban. Ezt követően 160 μl (3,7 mg/100 ml) 2,2-difenil-1-pikrhidrazil (DPPH) metanolos oldatát vittük minden egyes mélyedésbe, majd 30 perces inkubálás után szobahőmérsékleten, sötétben, az abszorbanciát 517 nm-en mértük Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA) segítségével. Az egyes minták és a referenciastandard szabadgyökfogó aktivitását a következő képlet alapján kapott gátlási százalékban határoztuk meg:

Az Absample a kivonat abszorbanciája DPPH-val, az Abblank a kivonat abszorbanciája DPPH nélkül és az Abcontrol a metanol és a DPPH abszorbanciája. A DPPH szabadgyök 50%-át csökkentő minták koncentrációját (IC50) úgy határoztuk meg, hogy a gátlás százalékos arányát ábrázoltuk a minták koncentrációjával. A vizsgálatot háromszor ismételtük meg, és az eredményeket átlag ± standard eltérésként adtuk meg.

ABTS vizsgálat

A kivonatok és frakciók ABTS gyökfogó képességét Re et al. módszerével határoztuk meg, enyhe módosításokkal. Röviden, az ABTS gyököt 7 mM ABTS oldat és 2,45 mM kálium-perszulfát oldat 12 órán keresztül szobahőmérsékleten történő reakciójával állítottuk elő. Az ABTS gyök törzsoldat abszorbanciáját 7,00 ± 0,02-re állítottuk be 734 nm-en a felhasználás előtt. A HPLC-minőségű metanolban (Sigma-Aldrich, Németország) feloldott kivonatok vagy frakciók 40 μl oldatát mikrotiterlemezekre vittük, és sorozatosan húzószeresen 15,62 és 2000 μg/ml koncentrációtartományig hígítottuk. Troloxot (Sigma, Németország) és L-aszkorbinsavat (Sigma, Németország) 200 és 1,56 μg/ml közötti koncentrációban készítettünk. Ezt követően 160 μl ABTS-oldatot adtunk a kutakhoz (kivéve a vakpróbát), majd 6 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 6 percig 734 nm-en mértük az abszorbanciát. Pozitív kontrollként a troloxot és az aszkorbinsavat, negatív kontrollként a metanolt, vakként pedig az ABTS nélküli kivonatokat vagy frakciókat használtuk. Az ABTS-+ gátlás százalékos arányát és az IC50-et a DPPH-mérés fentebb leírt módon számoltuk ki.

Citotoxicitási vizsgálat

Az aceton kivonatok és frakciók Vero majomvese sejtekkel szembeni citotoxicitását a korábban leírt MTT redukciós teszttel vizsgáltuk, enyhe módosításokkal. A sejteket 1 × 105 sejt/ml sűrűségben (100 μl) 96 lyukú mikrotiterlemezekbe vetettük, és 37°C-on, 5% CO2 mellett, párásított környezetben inkubáltuk. 24 órás inkubáció után különböző végkoncentrációjú mintákat (100 μl) adtunk a sejteket tartalmazó lyukakhoz. Pozitív referenciaként a doxorubicint használtuk. Egy megfelelő vakkontrollt is bevontunk az aceton azonos koncentrációjával, és a lemezeket további 48 órán át inkubáltuk CO2 inkubátorban. Ezt követően az egyes mélyedésekben lévő tápfolyadékot leszívtuk a sejtekről, amelyeket ezután PBS-szel mostunk, és végül friss tápfolyadékot (200 μl) adtunk minden egyes mélyedésbe. Ezután 30 μl MTT-t (5 mg/ml PBS-ben) adtunk minden egyes mélyedésbe, majd a lemezeket 37°C-on inkubáltuk 4 órán át. A tápfolyadékot kiszívtuk a mélyedésekből, és DMSO-t adtunk a képződött formazánkristályok szolubilizálására. Az abszorbanciát egy BioTek Synergy mikrolemezolvasóval 570 nm-en mértük. Az egyes kivonatok sejtnövekedés-gátlását LC50-értékben fejeztük ki, amelyet a sejtek életképességének 50%-os gátlását okozó koncentrációként határoztunk meg. A szelektivitási index (SI) értékeket úgy számoltuk ki, hogy a citotoxicitási LC50 értékeket elosztottuk a MIC értékekkel (SI = LC50/MIC). A vizsgálatokat négy példányban végeztük, és minden kísérletet háromszor ismételtünk meg.

Statisztikai elemzés

Minden kísérletet három példányban végeztünk, és az értékeket átlag ± standard eltérésként fejeztük ki. Az értékek közötti különbségek szignifikanciáját varianciaanalízissel vizsgáltuk, az eredményeket pedig a Fisher-féle legkisebb szignifikáns különbség (LSD) segítségével hasonlítottuk össze 5%-os szignifikanciaszinten.