Resultat och diskussion

Caspase-3 och caspase-7 uppvisar olika aktivitet mot syntetiska substrat.

Caspase-3 och caspase-7 aktiveras båda universellt under apoptos, oberoende av det specifika stimulus som initierar döden, och båda proteaserna anses allmänt samordna apoptosens rivningsfas genom att klyva ett varierat utbud av proteinsubstrat (1, 2). Det relativa bidraget från dessa proteaser till cellulär nedbrytning är dock fortfarande till stor del spekulativt. Caspase-3 och caspase-7 är närmast besläktade med varandra, jämfört med andra caspaser från däggdjur, men uppvisar ändå betydande sekvensskillnader, med en total sekvensidentitet på 56 % och en sekvenslikhet på 73 % (fig. 1A). För att utforska substratpreferenserna hos dessa caspaser mer i detalj uttryckte vi båda enzymerna som His-märkta proteiner i bakterier och renade dessa till homogenitet (Fig. 1B). Båda caspaserna var aktiva plats-titrerade mot DEVD-AFC i kombination med polycaspashämmaren zVAD-fmk (fig. 1C). Baserat på titreringsdata för den aktiva platsen normaliserades den aktiva koncentrationen för varje enzym för att möjliggöra direkta jämförelser mellan dessa enzymer i efterföljande experiment (fig. 1D). Vi jämförde sedan dessa caspaser med avseende på deras förmåga att hydrolysa en panel av syntetiska tetrapeptidsubstrat. Som framgår av figur 1E klyver båda caspaserna företrädesvis DEVD-AFC med i stort sett identisk effektivitet. Däremot klyvde caspase-3 LEHD-AFC effektivare än caspase-7, vilket tyder på att dessa proteaser har olika aktiviteter mot vissa syntetiska substrat (fig. 1E).