ABSTRACT

Prior à ligadura, cada fragmento de Okazaki sintetizado no filamento retardado em eucariotas deve ser processado nucleoliticamente. A clivagem da nucleotomia ocorre no contexto de estruturas de flap de 5′ geradas através da síntese do delta da polimerase do DNA. Pelo menos três nucleases de ADN: Rad27 (Fen1), Dna2, e Exo1, foram implicados no processamento de retalhos de fragmentos de Okazaki. No entanto, nem as contribuições de nucleases individuais para a síntese de fásico nem a estrutura dos intermediários de DNA formados em sua ausência foram claramente definidas in vivo. Ao esgotar condicionalmente as nucleases de fagulhas e analisar diretamente os fragmentos de Okazaki sintetizados in vivo em S. cerevisiae, nós conduzimos uma avaliação sistemática do impacto do Rad27, Dna2 e Exo1 na síntese de fagulhas. Verificamos que o Rad27 processa a maioria dos retardatários, com uma contribuição adicional significativa do Exo1, mas não do Dna2. Quando a clivagem da nuclease é prejudicada, observamos uma redução na síntese de desfasamento, ao contrário da geração generalizada de retalhos longos de Okazaki de 5′, como previsto por alguns modelos. Além disso, usando construções restritas ao ciclo celular, nós demonstramos que tanto o processamento nucleolítico quanto a ligação dos fragmentos de Okazaki podem ser desacoplados da replicação do DNA e atrasados até que a síntese da maioria do genoma esteja completa.