Holmes was medaillewinnaar op het 2005 PGA Tour Qualifying Tournament. Hij eindigde als tiende in zijn eerste PGA Tour start tijdens het 2006 Sony Open in Hawaii en in februari van dat jaar won hij het FBR Open, waardoor hij de snelste golfer werd die $1.000.000 verdiende in zijn carrière op de PGA Tour. Het was zijn vijfde toernooi als professional en zijn vierde op de PGA Tour.

Na deze overwinning viel zijn vorm weg, en dit zette zich voort in 2007 toen hij slechts 2 top tien finishes haalde en het jaar eindigde op de 118e plaats op de geldlijst.

Op 3 februari 2008 won Holmes het FBR Open voor de tweede Tour-overwinning uit zijn carrière en veroverde ook de toernooititel voor de tweede keer in drie jaar. Hij begon de laatste ronde met vier slagen voorsprong, maar op de 18e tee had hij één slag achterstand op Phil Mickelson. Holmes sloeg een birdie op de 18e om een play-off af te dwingen en versloeg Mickelson op de eerste play-off hole (de 18e) door een 6-foot birdie putt te maken na een drive van 359-yard. Deze overwinning bracht Holmes naar de 62e plaats op de Official World Golf Ranking. In 2008 bereikte Holmes de 42e plaats op de OWGR.

Speelwijze

Holmes, samen met andere debutanten uit 2006 zoals Camilo Villegas en Bubba Watson, staat bekend om het slaan van lange afstanden, meer dan 300 yards (312.7 yards, waarmee hij nummer 2 is in driving distance, slechts 6 yards achter de leider, Watson). Als zodanig speelt hij cursussen door routinematig zijn driver zo ver als hij kan te slaan, wat doet denken aan John Daly’s “Grip it and Rip It” filosofie, en zijn afstandsvoordeel te gebruiken om hem dichter bij de green te brengen en in positie voor een wedge of kort ijzer naar de green. Hoewel de speelstijl niet nieuw is, hebben veel critici geklaagd dat de stijl van J.B. Holmes een nieuwe golf van golfers heeft ingeluid die zich toeleggen op het slaan van de bal zo ver als ze kunnen, geholpen door de nieuwere golfuitrusting aangeboden door golfclubbedrijven en het hacken van de bal uit de rough op de green, effectief elimineren van het egaliserende effect dat de golfsport gewoonlijk biedt aan kortere, nauwkeurige hitters.

2008 Ryder Cup

In de Ryder Cup 2008 versloeg Holmes Europa’s Søren Hansen met 2&1 tijdens het enkelspel op zondag om de Verenigde Staten binnen één punt te brengen van het winnen van de Ryder Cup. Jim Furyk zou later Miguel Ángel Jiménez op de 17e hole verslaan om de Ryder Cup te winnen. Holmes en een andere Ryder Cup-teamgenoot, Kenny Perry, werden door het tijdschrift Kentucky Monthly uitgeroepen tot Kentuckians of the Year 2008.

Hersenoperatie

Na een 80 in de eerste ronde trok Holmes zich in augustus terug van het 2011 PGA Championship. Hij had al enkele maanden last van duizeligheid en uiteindelijk werd bij hem een structurele afwijking in de kleine hersenen vastgesteld, een Chiari-malformatie. Hij onderging een hersenoperatie op 1 september 2011 en ongeveer een maand later ontdekten de dokters dat Holmes allergisch was voor de lijm die gebruikt werd op de titanium plaat aan de basis van zijn schedel. Hij werd vanuit zijn huis in Kentucky per vliegtuig naar Johns Hopkins in Baltimore gebracht voor een nieuwe operatie. Holmes keerde eind januari 2012 terug op de PGA Tour tijdens het Farmers Insurance Open.

2012-15: Herstel en comeback

Na de hersenoperatie speelde Holmes in 26 evenementen in 2012. Elleboog- en enkelblessures beperkten hem tot zes PGA Tour-evenementen in 2013 en hij speelde niet meer tot het Dunlop Phoenix Tournament op de Japan Golf Tour. Holmes voldeed aan zijn medische verlenging door verdiensten op de 2014 Zurich Classic of New Orleans, waar hij T11 eindigde. Hij zou een T63 nodig hebben op het Wells Fargo Championship om via FedEx Cup punten toegang te verdienen tot het 2014 Players Championship. Holmes won voor het eerst in zes jaar, kreeg zijn Tourstatus voor het seizoen 2015-2016 terug en steeg van de 242e naar de 68e plaats op de Official World Golf Ranking. De overwinning leverde Holmes ook toegang op tot het 2014 PGA Championship op Valhalla Golf Club in Louisville, Kentucky.

In februari 2015 verloor Holmes in een vierkoppige sudden-death play-off op het Farmers Insurance Open. Hij had een co-lead na de 54-holes etappe met Harris English, maar kon alleen een level-par laatste ronde schieten om de play-off in te gaan. Op de eerste playoff hole maakte Holmes een birdie om door te gaan naar de tweede playoff hole met Jason Day, nadat English en Scott Stallings met pars waren uitgeschakeld. Op de par-three tweede playoff hole, vloog Holmes over de green en kon niet in tweeën neerkomen vanaf de back rough, waardoor Day twee putts van 15 voet overhield voor de overwinning.

In de eerste ronde van het WGC-Cadillac Championship, schoot Holmes een 62 voor een totaal van 10-onder-par om met vier slagen te leiden na de eerste dag. Zijn ronde bevatte acht birdies en een eagle om het toernooirecord te evenaren. Holmes behield zijn leiding na de tweede ronde, ondanks een 73-over-par. Hij ging met twee slagen voorsprong het weekend in en opende een voorsprong van vijf slagen na een 70 in de derde ronde, met onder andere een hole-in-one op de par-3 vierde hole. Maar zijn voorsprong was verdwenen bij de zesde hole in de laatste ronde, nadat hij drie van zijn eerste zes holes bogey had gespeeld. Holmes speelde de rest van zijn ronde in even-par en zou met een 75 finishen één achter winnaar Dustin Johnson. Zijn runner-up finish bewoog Holmes naar de 19e plaats op de wereldranglijst, zijn hoogste plaatsing ooit tot nu toe.

2018

In januari 2018 werd Holmes bekritiseerd door zijn collega-profs op sociale media nadat hij vier minuten en tien seconden over zijn tweede schot naar de 18e hole had gedaan in de laatste ronde van het Farmers Insurance Open. Holmes had een eagle nodig om in een play-off te komen, maar legde uiteindelijk af. Holmes later zei dat hij was ‘geschokt’ door de negatieve reactie op incident, opmerkingen die een andere backlash aangewakkerd. Collega-prof Justin Thomas verdedigde Holmes echter en zei dat hij precies hetzelfde zou hebben gedaan als hij in zijn positie was geweest.

2019

Op 17 februari 2019 won Holmes het Genesis Open, zijn vijfde PGA Tour-overwinning en eerste in bijna vier jaar. Holmes overwon een achterstand van vier slagen in de laatste ronde om één slag voor te eindigen op de 54-holes leider Justin Thomas, aan het einde van een marathon 34-holes finaledag. Het beslissende moment vond plaats op de 13e hole tijdens de laatste ronde, toen Holmes een 12-foot par putt holde en Thomas twee korte putts miste, wat resulteerde in een dubbele bogey.

Holmes deelde de 36-holes leiding op het 2019 Open Championship op Royal Portrush met de Ier Shane Lowry. Holmes schoot openingsrondes van 66-68 voor een totaal van acht onder. Hij was echter niet in staat om het voor elkaar te krijgen in het weekend, door 69-87 te schieten en te zakken naar een gelijkspel voor de 67e plaats.