Abstract

メキシコ・ユカタン半島の薬用植物について、特に癌に対する新しい治療薬を探す研究はほとんど行われていない。 本稿では，マヤの伝統医学で口腔内の慢性的な傷害の治療に利用されている植物Bonellia albifloraの抽出物の細胞毒性能を評価した。 我々は、ソックスレー装置を用いた抽出により、植物の様々な部位のメタノール抽出を実施した。 各抽出物について、極性の高い溶媒を用いた液液分画を行った。 すべての抽出物および分画について、96ウェル細胞培養プレートを用いたテトラゾリウム色素還元（MTT）アッセイにより、4つのヒト癌細胞株と1つの正常細胞株に対する細胞毒性活性を評価した。 根皮メタノール抽出物は、ヒト中咽頭癌細胞株（KB）に対して非常に高い細胞毒性活性を有しており、そのヘキサン画分は活性代謝物を濃縮し、カスパーゼ3および8を活性化することでアポトーシスを誘導することが明らかとなった。 この結果は、B. albiflora hexanic fraction の細胞毒性能を実証し、マヤの伝統的な薬用植物の研究の重要性を立証するものである。 はじめに

伝統医学は、古代から現代に至るまでメキシコの先住民プエブロの住民によって行われており、その中にはメキシコ・ユカタン半島のマヤ族も含まれる。 マヤの伝統医学において、植物は非常に重要であり、それは多くの種類の病気のコントロールに有効であることの証拠と考えることができる。 同様に、植物は、特にプライマリーヘルスサービスが利用できない地域社会で、ヘルスケアのための最も重要な代替手段の1つを構成しています。 さらに、天然再生可能な資源として、広く活用することができる。 先に述べたことと合わせて、先住民族のプエブロの伝統医学が世界保健機関（WHO）に認められ、薬用植物の研究への強力な推進力となったのです。

マヤの民族植物学の文献は、その大部分が歴史的または記述的研究で構成されており、その内容は、異なる時代のマヤの治療者が知っている病気や治療法の大要が中心となっています。 マヤの人々は、感染症（腸炎、感染性皮膚炎、呼吸器感染症）、慢性疾患（喘息、疲労、腎炎、高血圧）、精神疾患（不眠、神経症、ヒステリー）などの異なる疾患を知り、治療していたのである。 ユカタン半島の伝統的なマヤ医学では、「癌」は、皮膚や隣接する筋肉の腫れ、または内臓の痛みの形で現れる病気または一連の病気として知られています。 この言葉は、治りにくい病気や嫌な様相を呈する病気（皮膚の場合）を意味し、内臓の癌であれば、患者の容貌から病名がわかるという。 マヤ語では、「がん」は「ツヌズ」または「ツヌズタカン」と呼ばれ、硬い突起や腫瘍は「チュチュム」と呼ばれます。

先行研究では、がんを示唆する徴候や症状の治療に、マヤ伝統医学で利用されている植物の抽出物は、細胞毒性活性を持っていることが証明されています . 同様に、ユカタン半島の Bonellia 属の 2 種 (Bonellia macrocarpa と Bonellia flammea) について行われた 2 つの研究によって、抗発癌活性を持つ活性剤などの新規化合物の存在が明らかになりました。 ユカタン半島には 5 種類の Bonellia 属があり、そのうち B. macrocarpa, B. flammea, B. albiflora はマヤの伝統医学で皮膚科系の疾患の治療薬として用いられている。 この3種のうち、B. albifloraだけが植物化学的・生物学的活性の研究対象になっていない。 B. albiflora はマヤの伝統医学では「シイク」と呼ばれ、鎮咳薬として皮膚や口の傷の治療、歯痛の痛みを和らげるために使用されている。 本研究では、B. albifloraの有機抽出物の細胞毒性について評価することを提案した。 植物材料

Bonellia albiflora (Lundell) B. Ståhl and Källersjöは、2010年の夏にメキシコ、ユカタン州の異なる地域から収集されました。 植物体はユカタン科学研究センター（CICY）天然資源部の分類学者によって同定・鑑定された。 化学物質

ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、熱不活性化牛胎児血清（FBS）、ペニシリンとストレプトマイシン（PS）は、米国カリフォルニア州カールズバッドのGibcoから購入した。 3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide (DMSO), and etoposideはSigma, St.Louis, MO, USAから購入した。 カスパーゼアッセイキットおよびアポトーシスDNAラダリングキットは、BioVision Research Products, Palo Alto, CA, USAから購入した

2.3. 抽出と分画

各植物部分を分離し、乾燥させ、粉砕した。 分離した植物体の乾燥粉末（100g）を、ソックスレー装置を用いて、メタノール（500mL）を用いて60℃の温度で、網羅的に抽出した。 上澄みを濾過し、ローテバポレーターを用いて真空下で蒸発させ、乾燥エキスを得た。 各植物材料のメタノール抽出物（10 mg）を20 mLのメタノール：水（1：3）に懸濁し、極性が増加する溶媒：ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル50 mLを用いて順次抽出し、最終残留抽出物が水性画分となるようにした。 活性ヘキサン抽出物（5 mg）をガスクロマトグラフ質量分析（GC-MS）によりフィンガープリントを得た。 細胞株と培養

中咽頭癌（KB ATCC-CCL-17）、喉頭癌（Hep-2）、子宮頸部腺癌（HeLa ATCC-CCL-2）、子宮頸部扁平癌（SiHa ATCC-CCL-35）と正常細胞株1株です。 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）のイヌ細胞腎臓（MDCK ATCC-CCL-34）は、East Biomedical Research Center-IMSSのVeronica Vallejo-Ruízの好意により提供された。 細胞は、100 units/mL penicillin Gと100 μg/mL streptomycinを補充した10％SFBを含むDMEM培地で、5％CO2-95％加湿空気中、37℃で培養した

2.5. 細胞毒性アッセイ

細胞毒性は、DenizotおよびLangによって記載された方法に若干の修正を加えて、MTTアッセイによって決定された。 簡単に説明すると、各細胞株の生存細胞を96ウェルプレートに播種し、24〜48時間培養し、細胞が>70%コンフルエンスに達した時点で培地を交換し、DMSO（最高濃度0.05%）に溶解した抽出物で細胞を2.34〜300g/mLで処理した。 48時間培養後、各ウェルに10 μL MTT (5 mg/mL) を加え、37℃で4時間培養した。培地を除去し、フォルマザン沈殿を100 μL の酸性化イソプロパノール (0.4 N HCl) に溶解させた。 分光光度計で540 nmの波長で光学濃度を測定した。 0.05% DMSOとドセタキセルで処理した細胞をそれぞれネガティブコントロールとポジティブコントロールとして使用した。 50%の細胞を死滅させる抽出物の濃度（CC50）は、GraphPad Prism 4.00 ソフトウェアによって算出した。 すべての測定は3連で行った。 MDCK細胞株は、抽出物の選択指数（SI）を評価するために使用した。 SIは、正常細胞および癌細胞株からの細胞毒性活性の比率として定義される

2.6. GC-MS分析

クロマトグラフィー分離は、質量選択検出器、モデル5975Bと結合したAgilentガスクロマトグラフ、モデル6890NでGC-MS分析によって行われました。 DB-5 ms キャピラリーカラム (30 m × 0.32 mm i.d., 0.25 μm film thickness) (J&W Scientific, Folsom, CA, USA) で化合物の分離を行いました。 試料1マイクロリットルをスプリットモード（50 : 1）でGC-MSに注入した。 インジェクター温度は250℃であった。 カラム温度は、初期温度160℃で3分間、10℃/分で240℃、240℃で2分間、5℃/分で250℃、250℃で10分間、5℃/分で300℃、300℃で10分間とプログラムされた。 質量検出器の条件は、電子衝撃（EI）モード：70 eV、ソース温度：230℃、走査速度：0: スキャン速度：1スキャン/秒、質量取得範囲：20-600amu、溶媒遅延：4分。 キャリアガスは1mL/minでヘリウムを使用。 揮発性成分の同定は、NIST Standard Reference Database Version NIST 05 for Windows を用いてマススペクトルを比較することにより暫定的に行った。 ボネジオール化合物の真正標準物質は、CICYのPeraza-Sánchez博士の好意により提供されました。 DNAフラグメンテーションの分析

DNAフラグメンテーションは、Tongらによって記載された方法に従って決定された。 簡単に言えば、細胞を10および50μg/mLの抽出物で処理し、6、12および24時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を遠心分離によって採取し、氷冷PBSで2回洗浄した。 アポトーシスDNAラダー抽出キット（BioVision apoptotic DNA ladder extraction kit）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってDNAを単離した。サンプル中のDNAは、1 μg/mL of ethidium bromideを含む1.5%アガロースゲル上で分離した。 DNAのバンドは紫外線照射下で可視化し、写真に収めた。 カスパーゼ活性のアッセイ

カスパーゼ3、8、9活性は、FLICE/Caspase Colorimetric assay kitを用いて、メーカーのプロトコルにしたがって行った。 簡単に言うと、10または50μg/mLの抽出物で6、12または24時間処理した細胞を採取し、PBSで洗浄し、800×gで4℃、10分間遠心分離した。 細胞ペレットを50μLの溶解バッファーに再懸濁し、氷上で10分間インキュベートした後、10,000×gで1分間遠心分離を行った。 上清を1.5 mL チューブに採取し、氷上で保存した。 タンパク質濃度を測定した後、200μgのタンパク質を50μLの細胞溶解用緩衝液に溶解させた。 各サンプルに10 mM DDTを含む反応バッファー を加えた。 最後に、各カスパーゼの特異的基質（DEVD-ρNA、IETD-ρNA、LEHD-ρNA）をサンプルに加え、37℃で1時間インキュベートし、405 nmで読み取った。 酵素活性は対照試料に対する倍率で表した

3. 結果と考察

3.1. メタノール抽出物の細胞毒性

B.albifloraの異なる部位からのメタノール抽出物の細胞毒性の結果を表1にまとめました。 根皮のメタノール抽出物は，B. albifloraの葉と茎の抽出物と比較して最も興味深い細胞毒性活性を示し，4つのヒト癌細胞株に対するCC50は12-31 μg/mLであった。 KB細胞株は、CC50が12.64μg/mLと、抽出物に対してより高い感受性を示した。 非腫瘍イヌ腎臓細胞株MDCKは、評価した細胞株のSIが>5で、抽出物の効果に対する感度が低かった（表1）。 米国国立がん研究所（NCI）は、細胞毒性活性が期待できる粗抽出物は、CC50が≦30μg/mLであることを提唱しており、この抽出物は今後の研究にとって重要であると特定された。 これらのデータは、ヒト細胞株に対するB. macrocarpa-根のメタノール抽出物の活性で得られたデータと同様である。 KB、前立腺腺癌（PC3）、子宮頸部扁平上皮癌（SiHa）、乳腺癌（MCF-7）、子宮頸部腺癌（HeLa）および喉頭癌（Hep-2）。

KB細胞株に対してのみ、葉の抽出物はCC50が23で、最大活性において第二位であった。NCI基準で85μg/mL、次いで茎の樹皮の抽出物であったが、KBとHep-2細胞株には細胞毒性が弱かった

3.2. フラクションの細胞毒性活性

植物の異なる部位のメタノール抽出物は、後の細胞株における細胞毒性試験のために極性の増加する溶媒で分画されました。 根皮メタノール抽出物を液液分配して得られたヘキサン画分（HFBa）は、元の抽出物と比較して優れた細胞毒性作用を示し、異なる細胞株におけるCC50は2〜27μg/mLであった（表2）。 また、ヘキサン画分のSIは、評価した細胞株においてオリジナルエキスと比較して改善された（SI = 5-54）。 樹皮と葉の抽出物のメタノール画分は、>200μg/mLの濃度では活性を示さなかった（データは示さず）。

B. macrocarpa根のメタノール抽出液から生理活性成分としてボンダイオールを単離した。 本研究では、この化合物を低濃度で検出したことから、化学走性指標となる可能性がある。 また、B. pungens などの他種からはトリテルペンが、B. ruscifolia からは2つのトリテルペンが単離されているが、生物活性に関する報告はない。 今回、我々は活性ヘキサン画分中にラノステロール由来のトリテルペンが存在する証拠を得たに過ぎない。 さらに、ユビキチン化されたステロール、スティグマステロールの誘導体も検出された。 近年、植物由来の薬理活性化合物の研究が盛んに行われているだけでなく、植物抽出物そのものや、単一の化合物よりも優れた生物活性を示す化合物の混合物の研究が盛んに行われている。 本研究では、今後の標準化のためにGC-MSで行ったHFBaのフィンガープリンティングとして、その成分を記述する。 また、”HFBa “は、”HFBa “と “HFBa “を組み合わせたもので、”HFBa “は、”HFBa “と “HFBa “を組み合わせたもので、”HFBa “は、”HFBa “を組み合わせたものである。 同様に、HFBaはKB細胞株でアポトーシスの形態を誘導することが示された。 これらの結果から、KB細胞株で最大の細胞毒性とアポトーシス形態特性を示したヘキサン画分が、このプロセスを誘導できるかどうかを評価するため、アポトーシスのプロセスの典型であるDNAの断片化について評価した。 図2は，50μg/mLのHFBaで処理し，18時間培養した後のKB細胞における典型的なDNAの断片化を示している。 いくつかの研究により、ある種の植物メタノール抽出物のアポトーシス作用が示されている 。 しかし、この活性を有すると思われる化合物の化学的特性を調査した研究はほとんどない。 それらの数少ない研究では、一般的に低極性有機画分が細胞株に対するアポトーシス効果に関与していることが分かっており、本研究で得られた結果と一致している。

HFBa中の化合物がアポトーシス誘導に関与しているかどうかは不明であるが、10μg/mLでDNA断片化を誘導するHFBaと異なり、抽出物中に存在しながらアポトーシス誘導に高濃度を必要とするボンジオールなどの単一化合物に帰することはできない（データ未掲載）。 上記に関して、HFBaの成分としてボネジオールに加え、ドデカン酸およびスチグマステロールの誘導体が存在することを報告する。 これらの化合物は、Crocus sativusのヘキサン画分に観察された細胞毒性活性と関連している。 さらに、一部の著者は、スチグマステロールの誘導体が、アポトーシスに依存する癌細胞株において有意な細胞毒性活性を示すことを実証している 。 特に、スピナスタオール（stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol）は、in vivoで皮膚腫瘍の発生率を減少させることを実証している。 実際、スピナステロールと今回報告された誘導体は、スピナステロールの22位とスティグマステロール誘導体の16位のダブルエンドレスが異なっている。 おそらく、スティグマスタ-7, 22-dien-3beta-olが本研究で観察された細胞毒性活性に寄与している可能性がある。 また、ラノスタン類はラノステロールから派生した四環系トリテルペノイドで、がん細胞に対してアポトーシス誘導を含む複数の活性を持つことが知られている。 活性ヘキサン画分に含まれるラノスタン系やスチグマステロール系の化合物は、ある程度の細胞毒性活性とアポトーシス誘導作用を有している可能性がある。 また、ヘキサン画分に含まれる複数の化合物が相乗的に作用して、細胞毒性やアポトーシスを誘導している可能性がある。 カスパーゼ活性の解析

DNA断片化の活性化のメカニズムが、内在性経路と外来性経路のどちらを経由したアポトーシスの活性化によって引き起こされたかを知るために、それぞれの特徴であるカスパーゼの活性を評価しました。 活性化プロファイルを得るために、インキュベーション期間は2、4、6、12時間であった。 50μg/mLのHFBaで6時間処理するとカスパーゼ8が活性化し、無処理の対照細胞（ネガティブコントロール）と比較して3倍の増加であった（図3）。 2、4、12時間の培養期間では、カスパーゼ8の活性化に増加は見られなかった。 カスパーゼ9は、50μg/mLのHFBaで処理したKB細胞では2-12時間の間活性化されず、内在性経路によるアポトーシス活性化の欠如が示唆された（図4）。 HFBa処理細胞ではカスパーゼ3活性がコントロールに比べて4倍上昇し、カスパーゼ8活性化と一致した（図5）。 カスパーゼ8活性の上昇は、アポトーシスの外来経路活性化の典型的な例であり、この活性化は他のプロカスパーゼ、中でもカスパーゼ3を活性化し、ラミニンA、フォドリン、アクチン、ゲルスリンなどの核タンパク質の分解を引き起こす。 また、図2に示すように、カスパーゼ活性化DNaseタンパク質阻害剤（ICAD）が放出され、DNA分解を目的としたカスパーゼ活性化DNase（CAD）酵素に変換される。 カスパーゼ9は活性化されなかったことから、B. albifloraは外来経路でアポトーシスを誘導すると結論づけられた。 このことは、このフラクションが癌治療の代替あるいは補助療法として大きな可能性を持っていることを証明している。 文献上では、植物からの抽出物とその内因性アポトーシス経路の誘導に対する効果に関するいくつかの研究がある。 例えば、Paeonia suffruticosa のメタノール抽出物は、ヒト胃がん細胞株 (AG3) にアポトーシスを誘導し、タンポポ根抽出物は慢性骨髄単球性白血病細胞株 (CMML) および薬剤耐性メラノーマ細胞にアポトーシスを誘導する能力がある . B. albiflora の活性画分に含まれる化合物のうち、どれがアポトーシスの外因性経路の活性化を引き起こすかは不明である。 しかし、天然および合成のトリテルペノイドを介した外因性シグナルの活性化によりアポトーシスが誘導されることが報告されている。 また、ポリアココスから単離されたラノスタン型トリテルペノイドであるポリポレン酸Cは、ヒト肺癌においてカスパーゼ8を介したアポトーシスを誘導することが報告されている . また、β-シトステロール（スチグマステロールの構造異性体）は、ヒト乳癌細胞においてFasシグナルを活性化し、外因性経路の活性化によりアポトーシスを誘導することが示されている。 このことから、本研究で用いた抽出物のトリテルペン成分とステロール成分の両方が、外因性経路の活性化を介したアポトーシスの誘導に大きな役割を果たすことが示唆されるかもしれない。

図3

我々の知る限り、マヤ伝統医学に用いられる植物のエキスにアポトーシスに対する効果があることが証明されたのはこれが最初である。 今後、抽出物の標準化やin vivoモデルでの評価を行う予定である。 また、細胞障害活性の原因となる化合物やアポトーシスの正確なメカニズムを解明するための追加研究が必要である。 結論

B. albifloraの根のヘキサン画分は細胞障害作用を示し、外因性経路を介してアポトーシスを誘導するので、がん治療への可能性が示唆された。 B. albifloraのヘキサン画分に存在する成分を完全に分離することを提案した。 albiflora を用いて細胞毒性試験およびアポトーシス誘導試験を行い、活性化合物の同定および作用機序の解明を行った。

Conflict of Interests

著者らは、本論文で言及したいかなる商業団体とも利害の衝突がなく、金銭的なつながりもないことを宣言する。

Acknowledgements

この論文はSEP-CONACYTCB-2010-156755により支援されました。 GC-MS分析時に技術協力をいただいたユカタン科学研究センター（CICY）バイオテクノロジー部のL. Torres-Tapia氏に感謝いたします。 さらに，本論文の英文校閲を担当したGlenn Jackson博士に感謝する

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