Abstract

Málo studií bylo provedeno na lékařské flóře mexického poloostrova Yucatan při hledání nových léčebných látek, zejména proti rakovině. V tomto článku jsme hodnotili cytotoxický potenciál extraktu z Bonellia albiflora, rostliny využívané v tradiční mayské medicíně k léčbě chronických poranění úst. Provedli jsme metanolové extrakty různých částí rostliny pomocí extrakce Soxhletovým zařízením. U každého extraktu jsme provedli frakci kapalina-kapalina s rozpouštědly se zvyšující se polaritou. Všechny extrakty a frakce byly hodnoceny z hlediska cytotoxické aktivity vůči čtyřem lidským nádorovým buněčným liniím a jedné normální buněčné linii pomocí testu redukce tetrazoliového barviva (MTT) v 96jamkových destičkách pro buněčné kultury. Metanolový extrakt z kořenové kůry měl mnohem větší cytotoxickou aktivitu u lidské buněčné linie rakoviny orofaryngu (KB); jeho hexanová frakce koncentrovala aktivní metabolity a indukovala apoptózu s aktivací kaspáz 3 a 8. Výsledky ukazují cytotoxický potenciál hexanové frakce B. albiflora a dokládají význam studia tradičních mayských léčivých rostlin.

1. Úvod

Tradiční medicína je praxe, kterou od starověku až do naší současnosti provozují obyvatelé původních mexických puebel, mezi něž patří i mayské obyvatelstvo poloostrova Yucatán v Mexiku. V tradiční mayské medicíně mají rostliny velký význam, což lze považovat za důkaz jejich účinnosti při potírání mnoha druhů nemocí. Stejně tak představují jednu z nejdůležitějších alternativ zdravotní péče, a to především v komunitách, kde nejsou dostupné primární zdravotnické služby. Kromě toho je lze široce využívat jako přírodní obnovitelný zdroj. Spolu s tím, co bylo popsáno dříve, byla tradiční medicína domorodých puebel uznána Světovou zdravotnickou organizací (WHO), což způsobilo silný podnět k výzkumu léčivých rostlin .

Májská etnobotanická literatura je ve své většině tvořena historickými nebo popisnými studiemi, v jejichž obsahu převažuje kompendium nemocí a léčebných postupů známých mayským léčitelům z různých období . Mayové znali a léčili různé nemoci, včetně nemocí infekčního původu (střevní infekce, infekční dermatitidy a infekce dýchacích cest), chronických nemocí (astma, únava, nefritida a hypertenze) a nemocí psychického typu (nespavost, nervozita a hysterie). Kromě toho léčili i další nemoci, například: abscesy, mozoly, otlaky, tvrdé výrůstky, polypy, nádory a bradavice nebo vředy, zpravidla hmatatelné nebo viditelné na kůži .

V tradiční medicíně Mayů na Yucatánském poloostrově je „rakovina“ známa jako nemoc nebo soubor nemocí, které se mohou projevovat postižením kůže nebo podkožního svalstva nebo postižením v podobě bolesti v některém vnitřním orgánu. Termín odkazuje na obtížně léčitelnou nemoc nebo na nemoc s nepříjemným aspektem (pokud postihuje kůži); pokud se jedná o vnitřní rakovinu, odhaluje nemoc podoba pacienta. Staří obyvatelé přiřazovali tomuto souboru příznaků názvy v mayském jazyce; v mayštině je „rakovina“ známá jako „tsunuz“ nebo „tsunuztacan“ a tvrdé výrůstky nebo nádory jako „chu’uchum“ .

Předchozí studie prokázaly, že výtažky z rostlin využívané v tradiční mayské medicíně k léčbě příznaků a symptomů svědčících o rakovině mají cytotoxickou aktivitu . Podobně dvě studie provedené na dvou druzích rodu Bonellia (Bonellia macrocarpa a Bonellia flammea) z poloostrova Yucatán odhalily přítomnost nových sloučenin, jako jsou účinné látky s antikarcinogenní aktivitou . V tomto kontextu se na Yucatánském poloostrově vyskytuje pět druhů rodu Bonellia, z nichž druhy B. macrocarpa, B. flammea a B. albiflora se používají v tradiční mayské medicíně k léčbě potíží dermatologického typu . Z těchto tří druhů pouze B. albiflora nebyla předmětem žádné fytochemické studie ani studie biologické aktivity. B. albiflora se v tradiční mayské medicíně označuje jako „Si’ik“ a používá se jako antitusikum k léčbě ran na kůži a v ústech a ke zmírnění bolesti zubů . V této práci jsme navrhli hodnocení cytotoxického potenciálu organických extraktů z B. albiflora.

2. Materiál a metody

2.1. Hodnocení cytotoxického potenciálu B. albiflora. Rostlinný materiál

Bonellia albiflora (Lundell) B. Ståhl a Källersjö byl sbírán na různých lokalitách státu Yucatán v Mexiku během léta 2010. Rostlinný materiál byl identifikován a ověřen taxonomy z Oddělení přírodních zdrojů Vědeckého výzkumného střediska Yucatánu (CICY).

2.2. Chemikálie

Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), tepelně inaktivované fetální hovězí sérum (FBS) a penicilin a streptomycin (PS) byly zakoupeny od společnosti Gibco, Carlsbad, CA, USA. 3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid (MTT), dimethyl sulfoxid (DMSO) a etoposid byly zakoupeny od firmy Sigma, St. Louis, MO, USA. Soupravy pro kaspázový test a souprava pro žebrování apoptotické DNA byly zakoupeny od společnosti BioVision Research Products, Palo Alto, CA, USA.

2.3. Extrakce a frakcionace

Každá rostlinná část byla oddělena, vysušena a rozemleta na prášek. Sušený prášek separovaného rostlinného materiálu (100 g) byl vyčerpávajícím způsobem extrahován pomocí Soxhletova přístroje při teplotě 60 °C methanolem (500 ml). Supernatant byl přefiltrován a odpařen ve vakuu pomocí rotační odparky, aby se získal sušený extrakt. Methanolový extrakt každého rostlinného materiálu (10 mg) byl suspendován ve 20 ml methanolu : voda (1 : 3) a extrahován postupně pomocí 50 ml rozpouštědel se stoupající polaritou: hexanu, dichlormethanu a ethylacetátu tak, aby konečným zbytkovým extraktem byla vodná frakce. Z aktivního hexanového extraktu (5 mg) byl získán otisk pro plynovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií (GC-MS).

2.4. Buněčné linie a kultivace

Buněčné linie karcinomu orofaryngu (KB ATCC-CCL-17), karcinomu hrtanu (Hep-2), adenokarcinomu děložního hrdla (HeLa ATCC-CCL-2) a dlaždicového karcinomu děložního hrdla (SiHa ATCC-CCL-35), jakož i jedna normální buněčná linie, buněk psí ledviny (MDCK ATCC-CCL-34) z American Type Culture Collection (ATCC) laskavě poskytla Veronica Vallejo-Ruíz z East Biomedical Research Center-IMSS. Buňky byly kultivovány v médiu DMEM obsahujícím 10 % SFB doplněného 100 jednotkami/ml penicilinu G a 100 μg/ml streptomycinu v 5 % CO2-95 % zvlhčeném vzduchu při teplotě 37 °C.

2,5. Test cytotoxicity

Citotoxicita byla stanovena pomocí MTT testu podle metody popsané Denizotem a Langem s určitými úpravami. Stručně řečeno, životaschopné buňky z každé buněčné linie byly nasazeny do 96jamkové destičky a inkubovány po dobu 24-48 h. Když buňky dosáhly >70% konfluence, médium bylo vyměněno a buňky byly ošetřeny extraktem rozpuštěným v DMSO (maximální koncentrace 0,05 %) v množství 2,34 až 300 g/ml. Po 48 h inkubace bylo do každé jamky přidáno 10 μl MTT (5 mg/ml) a inkubováno při 37 °C po dobu 4 h. Médium bylo odstraněno a formazanová sraženina byla rozpuštěna ve 100 μl okyseleného isopropanolu (0,4 N HCl). Optická hustota byla stanovena spektrofotometrem při vlnové délce 540 nm. Jako negativní a pozitivní kontrola byly použity buňky ošetřené 0,05% DMSO a docetaxelem. Koncentrace extraktu, která usmrtila 50 % buněk (CC50), byla vypočtena pomocí softwaru GraphPad Prism 4.00. Všechna stanovení byla provedena ve třech opakováních. K hodnocení selektivního indexu (SI) extraktů byla použita buněčná linie MDCK. SI je definován jako poměr cytotoxické aktivity z normálních buněk a nádorových buněčných linií.

2,6. Analýza GC-MS

Chromatografická separace byla provedena analýzou GC-MS na plynovém chromatografu Agilent, model 6890N, spojeném s hmotnostně selektivním detektorem, model 5975B. Sloučeniny byly separovány na kapilární koloně DB-5 ms (30 m × 0,32 mm i.d., tloušťka vrstvy 0,25 μm) (J&W Scientific, Folsom, CA, USA). Jeden mikrolitr vzorku byl vstříknut do GC-MS v režimu split (50 : 1). Teplota injektoru byla 250 °C. Teplota kolony byla naprogramována takto: počáteční teplota 160 °C po dobu 3 min, 10 °C/min na 240 °C, 240 °C po dobu 2 min, 5 °C/min na 250 °C, 250 °C po dobu 10 min, 5 °C/min na 300 °C a 300 °C po dobu 10 min. Podmínky hmotnostního detektoru byly následující: režim elektronického nárazu (EI) při 70 eV; teplota zdroje: 230 °C; rychlost skenování: 1 sken/s; rozsah akvizice hmotnosti: 20-600 amu; zpoždění rozpouštědla 4 min. Nosným plynem bylo helium při rychlosti 1 ml/min. Těkavé složky byly předběžně identifikovány porovnáním jejich hmotnostních spekter pomocí standardní referenční databáze NIST verze NIST 05 pro Windows. Autentický standard sloučeniny bonediolu laskavě poskytl Dr. Peraza-Sánchez z CICY.

2.7. Analýza fragmentace DNA

Fragmentace DNA byla stanovena podle metody popsané Tongem a spol. Stručně, buňky byly ošetřeny extraktem v koncentraci 10 a 50 μg/ml a inkubovány po dobu 6, 12 a 24 h. Po inkubaci byly buňky sklizeny centrifugací a dvakrát promyty v ledově chladném PBS. K izolaci DNA byla použita souprava pro extrakci apoptotické DNA (BioVision apoptotic DNA ladder extraction kit) podle protokolu výrobce; DNA ve vzorcích byla separována na 1,5% agarózovém gelu obsahujícím 1 μg/ml ethidium bromidu. Pásy DNA byly vizualizovány pod ultrafialovým osvětlením a byly vyfotografovány.

2,8. Testy aktivit kaspáz

Aktivity kaspáz 3, 8 a 9 byly provedeny pomocí soupravy FLICE/Caspase Colorimetric assay kit podle protokolů výrobce. Stručně řečeno, buňky ošetřené 10 nebo 50 μg/ml extraktu po dobu 6, 12 nebo 24 hodin byly sklizeny, promyty PBS a odstředěny při 800 ×g po dobu 10 minut při 4 °C. Buněčné pelety byly resuspendovány v 50 μl lyzačního pufru a inkubovány na ledu po dobu 10 min před centrifugací při 10 000 ×g po dobu 1 min. Supernatant byl odebrán do 1,5 ml zkumavky a uchováván na ledu. Po změření koncentrace proteinu bylo 200 μg proteinu rozpuštěno v 50 μl buněčného lyzačního pufru. Ke každému vzorku byl přidán reakční pufr s 10 mM DDT. Nakonec byl ke vzorkům přidán specifický substrát pro každou kaspázu (DEVD-ρNA, IETD-ρNA a LEHD-ρNA), vzorky byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 h a odečteny při 405 nm. Enzymová aktivita byla vyjádřena jako násobek oproti kontrolnímu vzorku.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Výsledky a diskuse Cytotoxická aktivita methanolových extraktů

Výsledky cytotoxicity methanolových extraktů z různých částí B. albiflora jsou shrnuty v tabulce 1. Methanolový extrakt z kůry kořene vykazoval nejzajímavější cytotoxickou aktivitu ve srovnání s extrakty z listů a kůry kmene B. albiflora s CC50 12-31 μg/ml na čtyři lidské nádorové buněčné linie. Buněčná linie KB vykazovala větší citlivost k extraktu s CC50 12,64 μg/ml. Nenádorová buněčná linie psích ledvin MDCK byla méně citlivá na účinky extraktu s SI >5 u hodnocených buněčných linií (tabulka 1). Americký Národní institut pro rakovinu (NCI) navrhl, že surové extrakty s potenciální cytotoxickou aktivitou jsou ty, které vykazují CC50 ≤30 μg/ml; tento extrakt byl tedy označen za důležitý pro budoucí studie . Tyto údaje jsou podobné údajům získaným u aktivních metanolových extraktů z kořene B. macrocarpa na lidských buněčných liniích: KB, adenokarcinomu prostaty (PC3), dlaždicového karcinomu děložního hrdla (SiHa), adenokarcinomu prsu (MCF-7), adenokarcinomu děložního hrdla (HeLa) a karcinomu hrtanu (Hep-2) .

Extrakt z listů byl druhý v největší aktivitě, a to pouze na buněčné linii KB s CC50 23. V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty CC50.85 μg/ml podle kritérií NCI, následovaný extraktem z kůry stonku, který byl méně cytotoxický na buněčné linie KB a Hep-2.

3.2. Účinnost extraktu z listů na buněčné linie KB a Hep-2. Cytotoxická aktivita frakcí

Metanolové extrakty různých částí rostliny byly frakcionovány rozpouštědly se zvyšující se polaritou pro pozdější studie cytotoxicity u buněčných linií. Hexanová frakce získaná rozdělením methanolového extraktu kořenové kůry (HFBa) kapalina-kapalina vykazovala ve srovnání s původním extraktem lepší cytotoxické účinky s CC50 mezi 2 a 27 μg/ml u odlišných buněčných linií (tabulka 2). SI hexanové frakce se rovněž zlepšila ve srovnání s původním extraktem v hodnocených buněčných liniích (SI = 5-54). Metanolové frakce extraktů z kůry a listů nebyly při koncentracích >200 μg/ml aktivní (údaje nejsou uvedeny).

Předtím jsme provedli biologicky řízenou studii k vyhodnocení antiproliferační aktivity B. macrocarpa, jejímž výsledkem byla izolace sloučeniny bonediolu, která vykazovala mírnou aktivitu u nádorových buněčných linií . Tato studie však neprokázala cytotoxické účinky HFBa srovnatelné s původním metanolickým extraktem u hodnocených buněčných linií (tabulka 2). Vysvětlením těchto výsledků může být, že bonediol inhibuje určitý bod buněčné proliferace (buněčný cyklus nebo replikaci DNA), zatímco účinky, které jsou pozorovány v cytotoxickém testu, jsou poškození nebo celková toxicita (apoptóza nebo nekróza) .

HFBa vykazoval lepší cytotoxické účinky ve srovnání s bonediolem a byl selektivnější vůči nádorovým než vůči normálním buňkám; SI se považuje za ukazatel biologické aktivity a nesouvisí s cytotoxicitou, pokud je SI >10 . V tomto ohledu splňovala tato kritéria pouze HFBa, která byla účinnější v buněčné linii KB s CC50 2,73 μg/ml; tato buněčná linie souvisí s rakovinou ústní dutiny a je v souladu s používáním rostliny v tradiční mayské medicíně při chronických lézích v ústní dutině , což je termín, který by mohl souviset s rakovinou

3.3. Analýza GC-MS

Identifikace a chemická analýza bioaktivní hexanové frakce pomocí GC-MS je zobrazena v tabulce 3. Chromatogram odhalil celkem osm píků, z nichž šest bylo identifikováno databází: kyselina dodekanová; kyselina tridekanová; kyselina 2-nonyl-malonová, dimethylester; stigmasta-7,16-dien-3-ol; 9,19-cyklo-lanost-24-en-3-ol; a bonediol. Poslední jmenovaný byl identifikován na základě retenčního času a porovnání hmotnostního spektra autentického standardu dříve izolovaného z B. macrocarpa . Byly zjištěny tyto hlavní složky: Kyselina 2-nonyl-malonová, dimethyl ester (37,39 %), dále pak stigmasta-7,16-dien-3-ol (13,63 %), kyselina dodekanová (13,22 %), 9,19-cyklo-lanost-24-en-3-ol (9,90 %) a bonediol (8,98 %). Neidentifikované složky s retenčními časy 8,092 (6,22 %) a 14,207 (5,38 %), stejně jako kyselina n-tridekanová (5,25 %), byly v HFBa minoritními sloučeninami (obr. 1).

Obrázek 1

Plynová chromatografie HFBa.

Z methanolového extraktu kořenů B. macrocarpa byl izolován bonediol jako bioaktivní složka. V této práci jsme zjistili přítomnost této sloučeniny v nízké koncentraci; lze ji tedy označit za možný chemotaxonomický marker. Kromě toho byl u jiných druhů, jako je B. pungens, izolován triterpen , a z B. ruscifolia byly izolovány dva triterpeny, bez zpráv o biologické aktivitě. V této práci jsme nalezli pouze důkaz přítomnosti triterpenu odvozeného od lanosterolu v aktivní hexanové frakci. Kromě toho jsme zjistili ubikvitinovaný sterol, derivát stigmasterolu. Pokud je nám známo, je to poprvé, co byly obě sloučeniny zaznamenány u tohoto rodu.

V posledních letech je častější nejen studium lékařsky bioaktivních sloučenin z rostlin, ale také studium samotných rostlinných extraktů nebo směsí sloučenin, které by společně mohly přinést lepší biologickou aktivitu, než jakou vykazuje jediná sloučenina . V této práci jsou tyto složky popsány jako fingerprinting HFBa provedený pomocí GC-MS pro budoucí standardizace.

3.4 Analýza složek HFBa. Fragmentace DNA

Na buněčných liniích KB jsme pozorovali, že methanolový extrakt z kořenů B. albiflora vykazuje typickou morfologii apoptózy (údaje nejsou uvedeny). Podobně bylo prokázáno, že HFBa vyvolává morfologii apoptózy na buněčných liniích KB. Tyto výsledky nás vedly k vyhodnocení, zda hexanová frakce, která vykazovala největší cytotoxicitu a morfologické charakteristiky apoptózy na buněčné linii KB, může tento proces indukovat; hodnotili jsme tedy fragmentaci DNA, typickou pro proces apoptózy. Fragmentace DNA byla zaznamenána od menšího k většímu rozsahu v rozmezí koncentrací ošetření 10 nebo 50 μg/ml a inkubační doby 6-24 h. Obrázek 2 ukazuje typickou fragmentaci DNA v buňkách KB po ošetření 50 μg/ml HFBa a 18 h inkubační době. Několik studií prokázalo apoptotický účinek některých rostlinných metanolových extraktů . Jen málo studií však zkoumalo chemické vlastnosti sloučenin, které mohou mít tuto aktivitu. V těchto několika málo studiích bylo obecně zjištěno, že za apoptotický účinek na buněčné linie jsou zodpovědné organické frakce s nízkou polaritou, což se shoduje s výsledky získanými v této studii .

Obrázek 2

Vliv hexanového extraktu z kořene Bonellia macrocarpa na fragmentaci DNA u buněk KB. Po ošetření buněk koncentrací 50 μg/ml B. macrocarpa po dobu 12 h byla DNA izolována a separována na 1,5% agarózovém gelu. DNA byla obarvena ethidium bromidem a vizualizována pod UV světlem. Dráhy 1 až 4: dráha 1 (negativní kontrola): DNA odebraná z neošetřených buněk KB po 18 h; pruh 2 (pozitivní kontrola): DNA odebraná z buněk KB ošetřených 50 μg/ml etoposidu po 18 h; pruh 3 (pozitivní): DNA odebraná z buněk KB ošetřených 50 μg/ml extraktu po 18 h; pruh 4:

Není známo, zda jsou za indukci apoptózy zodpovědné sloučeniny obsažené v HFBa, ale nelze ji přičítat jediné sloučenině, jako je bonediol, který je sice v extraktu přítomen, ale k vyvolání apoptózy vyžaduje vysoké koncentrace (údaje nejsou uvedeny), na rozdíl od HFBa, který vyvolává fragmentaci DNA při 10 μg/ml. S ohledem na výše uvedené uvádíme kromě bonediolu jako složky HFBa přítomnost kyseliny dodekanové a derivátu stigmasterolu. Tyto sloučeniny byly spojeny s cytotoxickou aktivitou pozorovanou u hexanové frakce Crocus sativus . Někteří autoři navíc prokázali, že deriváty stigmasterolu vykazovaly významnou cytotoxickou aktivitu u nádorových buněčných linií, která závisela na apoptóze . Zejména spinasterol (stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol) prokázal snížení výskytu kožních nádorů in vivo . Ve skutečnosti se spinasterol a derivát uváděný v této studii liší dvojitou vazbou v poloze 22 u spinasterolu a v poloze 16 u derivátu stigmasterolu. Možná, že stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol by mohl přispívat k cytotoxické aktivitě pozorované v této studii. Kromě toho je známo, že lanostany jsou skupinou tetracyklických triterpenoidů odvozených od lanosterolu, které mají mnohočetné aktivity proti rakovinným buňkám včetně indukce apoptózy . Je možné, že sloučeniny typu lanostanu a stigmasterolu uvedené v aktivní hexanové frakci mají určitý stupeň cytotoxické aktivity a účinek indukce apoptózy. Je pravděpodobné, že několik sloučenin přítomných v hexanové frakci působí synergicky na vyvolání cytotoxicity a apoptózy.

3.5. Analýza aktivity kaspáz

Abychom zjistili, zda mechanismus aktivace fragmentace DNA byl vyvolán aktivací apoptózy prostřednictvím vnitřní nebo vnější cesty, vyhodnotili jsme aktivitu kaspáz, která je charakteristická pro každou z nich. Inkubační doby byly 2, 4, 6 a 12 h, abychom získali profil aktivace. Kaspáza 8 byla aktivována po 6 h působení 50 μg/ml HFBa; nárůst byl třikrát vyšší ve srovnání s kontrolními buňkami bez působení (negativní kontrola) (obr. 3). Při inkubaci trvající 2, 4 a 12 h nebyl pozorován žádný nárůst aktivace kaspázy 8. Při inkubaci trvající 2, 4 a 12 h byla kaspáza 8 aktivována. Kaspáza 9 nebyla v buňkách KB po ošetření 50 μg/ml HFBa během 2-12 h aktivována, což svědčí o nedostatečné aktivaci apoptózy intrinsickou cestou (obr. 4). Aktivita kaspázy 3 se v buňkách ošetřených HFBa zvýšila čtyřnásobně ve srovnání s kontrolní skupinou, což je v souladu s aktivací kaspázy 8 (obr. 5). Zvýšení aktivity kaspázy 8 je typické pro aktivaci apoptózy vnější cestou, která následně aktivuje další prokaspázy, mezi nimi i kaspázu 3, což následně vede k degradaci jaderných proteinů, jako je laminin A, fodrin, aktin a gelsolin. Vede také k uvolnění proteinového inhibitoru kaspázou aktivované DNázy (ICAD) a jeho přeměně na enzym kaspázou aktivovanou DNázu (CAD), jejímž cílem je degradace DNA , jak je znázorněno na obrázku 2. Vzhledem k tomu, že kaspáza 9 nebyla aktivována, usuzujeme, že B. albiflora indukuje apoptózu vnější cestou. To dokládá velký potenciál, který tato frakce má jako alternativní nebo doplňková terapie při léčbě rakoviny. V literatuře je několik studií o extraktech z rostlin a jejich účincích na indukci vnitřní cesty apoptózy . Několik studií však prokázalo aktivaci vnější apoptózové dráhy rostlinnými extrakty; například metanolový extrakt z Paeonia suffruticosa indukuje apoptózu u buněčné linie lidského karcinomu žaludku (AG3) a extrakt z kořene pampelišky má schopnost indukovat apoptózu u buněčné linie chronické myelomonocytární leukémie (CMML) a u buněk melanomu rezistentních na léčiva . Není známo, která ze sloučenin přítomných v účinné frakci B. albiflora může způsobit aktivaci vnější cesty apoptózy. Bez ohledu na to existují zprávy o indukci apoptózy aktivací vnější signalizace zprostředkované přírodními a syntetickými triterpenoidy . Kromě toho triterpenoid lanostanového typu, kyselina polyporenová C izolovaná z Poriacocosu, indukuje apoptózu zprostředkovanou kaspázou-8 u lidského karcinomu plic . Bylo prokázáno, že β-sitosterol (strukturní izomer stigmasterolu) vyvolává apoptózu aktivací vnější dráhy a aktivuje signalizaci Fas u lidských buněk karcinomu prsu . To by mohlo naznačovat, že jak triterpenové, tak sterolové složky extraktu použitého v této studii by mohly hrát hlavní roli v indukci apoptózy zprostředkované aktivací vnější dráhy.

Obrázek 3

Působení hexanové frakce Bonellia macrocarpa v průběhu šesti hodin vyvolalo aktivaci kaspázy 8. Vlivem hexanové frakce Bonellia macrocarpa došlo k aktivaci kaspázy 8. Ošetření byla následující: DMSO (0,05 %), kontrola (bez ošetření), etoposid (50 μg/ml) a HFBa (50 μg/ml). Každý symbol představuje průměr ± SD relativní aktivace kaspáz ze tří testů, normalizovaný s kontrolní skupinou. Jednosměrná ANOVA: , ; Tukeyho post-hoc test: oproti DMSO a kontrolní skupině; oproti DMSO a kontrolní skupině; oproti HFBa.

Obrázek 4

Ošetření během 12 hodin hexanovou frakcí Bonellia macrocarpa nevyvolalo aktivaci kaspázy 9. Obrázek 4

Ošetření během 12 hodin hexanovou frakcí Bonellia macrocarpa nevyvolalo aktivaci kaspázy 9. Ošetření byla následující: DMSO (0,05 %), kontrola (bez ošetření), etoposid (50 μg/ml) a HFBa (50 μg/ml). Každý symbol představuje průměr ± SD relativní aktivace kaspáz ze tří testů, normalizovaný s kontrolní skupinou. Jednosměrná ANOVA: , ; Tukeyho post-hoc test: oproti všem skupinám.

Obrázek 5

Ošetření během 12 hodin hexanovou frakcí Bonellia macrocarpa vyvolalo aktivaci kaspázy 3. Obrázek 5

Ošetření hexanovou frakcí Bonellia macrocarpa vyvolalo aktivaci kaspázy 3. Ošetření byla následující: DMSO (0,05 %), kontrola (bez ošetření), etoposid (50 μg/ml) a HFBa (50 μg/ml). Každý symbol představuje průměr ± SD relativní aktivace kaspáz ze tří testů, normalizovaný s kontrolní skupinou. Jednosměrná ANOVA: , ; Tukeyho post-hoc test: oproti DMSO a kontrolní skupině; oproti DMSO a kontrolní skupině.

Podle našich znalostí je to poprvé, co bylo prokázáno, že extrakt z rostliny používané v tradiční mayské medicíně má vliv na apoptózu. Budoucí studie budou zaměřeny na standardizaci extraktu a jeho vyhodnocení pomocí modelů in vivo. Další studie jsou nezbytné pro objasnění sloučenin zodpovědných za pozorovanou cytotoxickou aktivitu a jejich přesný mechanismus apoptózy.

4. Závěry

Hexanová frakce kořenů B. albiflora má cytotoxické účinky a indukuje apoptózu prostřednictvím vnější cesty, což naznačuje její potenciál pro léčbu rakoviny. Navrhujeme kompletní izolaci složek přítomných v hexanové frakci B. albiflora pro hodnocení v cytotoxickém testu a indukci apoptózy, aby se objasnilo, které sloučeniny jsou účinné, a aby se pochopil mechanismus účinku.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů a nemají žádné finanční spojení s žádným komerčním subjektem uvedeným v článku.

Poděkování

Tento článek byl podpořen projektem SEP-CONACYTCB-2010-156755. Autoři děkují L. Torres-Tapia z biotechnologického oddělení Vědeckého výzkumného centra Yucatánu (CICY) za technickou pomoc při GC-MS analýze. Autoři jsou navíc vděčni Dr. Glennu Jacksonovi za recenzi článku v anglickém jazyce.