PMC
A NEBcutter
NEBcutter egy bemeneti szekvenciát fogad el, amely beilleszthető, felvehető egy helyi fájlból vagy az NCBI-ból GenBank fájlként lekérhető a hozzáférési számon keresztül. Különböző opciók állnak rendelkezésre a megjelenítendő ORF-ek méretének és a használandó restrikciós enzimek készletének kiválasztására. A program kiszámítja az összes restrikciós enzimhely pozícióját, megjegyezve azokat, amelyeket az átfedő metiláció potenciálisan blokkolhat, és megtalálja az ORF-eket a szekvenciában. Ezután megjeleníti a szekvencia sematikus ábráját, a hosszú ORF-eket a Módszerekben leírt szabályok alapján, valamint az összes olyan restrikciós enzimet, amely csak egyszer vágja azt. A kezdeti megjelenítés megmutatja azokat az enzimeket is, amelyekkel egy teljes emésztés során minden egyes megjelenített ORF-et ki lehet vágni. Az11. ábra egy tipikus emésztést mutat, ebben az esetben a pBR322 plazmid lineáris nézetét. Ha az eredeti DNS-szekvencia cirkuláris, akkor mind a lineáris, mind a cirkuláris megjelenítés lehetséges. A kezdeti megjelenítésből számos lehetőség van a továbblépésre, beleértve az egyéni emésztést az Ön által választott enzimekkel és az emésztés különböző megjelenítéseit. A lineáris megjelenítésből lehetőség van arra is, hogy a szekvencia egy kiválasztott régiójára ráközelítsünk, hogy részletesebb képet kapjunk. Az egyik lehetőség lehetővé teszi egy adott régió kiválasztását, és azoknak az enzimeknek a megjelenítését, amelyek közvetlenül a régió mellett vágnak. Ez hasznos a kívánt régiót kivágni képes enzimek megtalálásához. Ha a nagyítás egy <60 nukleotidból álló régióhoz vezet, akkor a tényleges szekvencia jelenik meg (2. ábra,2), a megfelelő fordítással együtt. Ezen a kijelzőn a szekvenciát vágó összes enzim megjelenik, a restrikciós enzim felismerő szekvenciájának részét képező összes bázis kiemelt, és ha az egeret az enzim neve fölé mozgatjuk, akkor egy doboz jelenik meg a felismerő szekvenciát jelölve, és maga a szekvencia aláhúzottá válik a kijelzőn.
A pBR322 plazmid egy emésztésének lineáris megjelenítése. Vegyük észre, hogy a két fő ORF-et olyan helyek (MseI és PflMI; BspHI és EarI) szegélyezik, amelyek segítségével kivághatók a teljes plazmidszekvenciából. Ebben az ábrázolásban csak olyan enzimek szerepelnek, amelyek egyszer hasítják a szekvenciát. A további emésztés és megjelenítés lehetőségei a megjelenítés alján található gombok segítségével érhetők el.
A pBR322 egy rövid régiójának nagyított megjelenítése. Vegyük észre, hogy a pirossal és kékkel kiemelt bázisok a restrikciós enzimek felismerőhelyeinek részeit alkotják. A pirosak egyértelműek, míg a kékek degenerált bázisok. A BsiEI tehát a CGRYCG szekvenciát ismeri fel. A külső CG-maradékok invariánsak, míg a belső bázisok degeneráltak, és az ábrázolt szekvenciában GT. A fekete színnel ábrázolt bázisok nem képezik részét egyetlen restrikciós enzim felismerőhelyének sem. Ez a megjelenítés hasznos lehet az SNP allélok megkülönböztetésére alkalmas restrikciós enzimek megtalálásához.
Minden fő megjelenítésen, ha az egeret egy restrikciós enzim neve fölé mozgatjuk, megjelenik annak felismerési szekvenciája és a pontos báziszám, amelynél hasít. Ha az enzimnek egynél több helye van, akkor az összes többi hely aláhúzva van. Az enzim nevére kattintva egy olyan oldal jelenik meg, amely összefoglalja az enzimre vonatkozó információkat, beleértve a metilációs érzékenységet, az előállított végződéseket, a rendelkezésre álló izoszkizomereket és a kompatibilis végződések előállítására alkalmas más enzimek listáját. A NEB-enzimek esetében az emésztési körülményekre vonatkozó információk és a NEB weboldalára mutató link is szerepel.
A NEBcutter egyik legfontosabb jellemzője, hogy mindent tartalmaz, amit a REBASE-ben rögzítettek a megjelenített enzimek bármelyikének metilációs érzékenységéről, ha azok egy Dam-helyet (GATC), egy Dcm-helyet (CCWGG), egy CpG-helyet, egy EcoKI-helyet (AACN6GTGC) vagy egy EcoBI-helyet (TGAN8TGCT) fednek le. Ha elméleti emésztéseket végzünk, az eredmények a metiláció hatásainak összehasonlítását tartalmazzák, kiemelve az eltolódó sávokat (33. ábra).
Elméleti emésztés, amely az átfedő Dcm-metiláció hatását mutatja a szekvenciában jelen lévő MscI-helyekre (felismerési szekvencia: TGGCCA), ha a bakteriofág lambda a Dcm-metiltranszferázt (felismerési szekvencia: CCWGG) expresszáló E.coli törzsben tenyészett volna. A Dcm-metiláció által érintett fragmentumok piros színnel vannak jelölve. A virtuális gél egy ismert méretű fragmensekkel előállított kísérleti adatokból generált köbös spline görbe interpolációján alapul.
Minden oldalon hot linkek találhatók, amelyek visszavezetnek a főoldalra, segítséget nyújtanak a megjelenítés értelmezéséhez, vagy lehetővé teszik, hogy a felhasználók megjegyzéseket küldjenek vissza a szerzőknek. A kezelőfelületet úgy alakítottuk ki, hogy a lehető legintuitívabb legyen, és a DNS-hasítással próbálkozó kutatók számára hasznos fő funkciókat könnyen elérhetővé tegye. A NEBcutter jelenlegi verziója több mint 400 000 szekvenciát dolgozott fel a felhasználóktól. Jelenleg számos fejlesztést készítünk elő a NEBcutterhez, és a 2.0-ás verzió megjelenését július 1-jére tervezzük.