Plazmidok 101: Fehérjeexpresszió
A molekuláris biológia központi dogmája: DNS→RNS→Protein. Egy adott fehérje szintéziséhez a DNS-t először át kell írni hírvivő RNS-é (mRNS). Az mRNS ezután a riboszómán lefordítható polipeptidláncokká, amelyek a fehérjék elsődleges szerkezetét alkotják. A legtöbb fehérjét ezután egy sor poszttranszlációs módosításon keresztül módosítják, beleértve a fehérje hajtogatást, a diszulfidhidak kialakítását, a glikozilálást és az acetilálást, hogy funkcionális, stabil fehérjéket hozzanak létre. A fehérjeexpresszió e folyamat második lépésére utal: a fehérjék mRNS-ből történő szintézisére és a poszt-transzlációs módosítások hozzáadására
Tudjon meg többet a molekuláris biológiáról a Plazmidok 101 eBook-ban!
A kutatók különböző technikákat alkalmaznak a fehérjeexpresszió szabályozására kísérleti, biotechnológiai és orvosi alkalmazásokhoz. A kutatók in vivo vizualizálhatják a fehérjéket fluoreszcens fehérjékkel való megjelöléssel a lokalizáció tanulmányozásához, vagy tisztíthatják a fehérjéket szerkezetük, kölcsönhatásaik és funkcióik tanulmányozásához. A fehérjéket a molekuláris biológiai kutatásokban (pl. polimerázok és más enzimek tisztíthatók és felhasználhatók a DNS manipulálására), vagy a gyógyászatban (pl. inzulin) történő felhasználásra is tisztíthatók.
A fehérjéket, ellentétben a viszonylag könnyen szintetizálható DNS-sel, sejtekből származó komplex keverékek felhasználásával vagy élő sejtek felhasználásával kell előállítani. A fehérjék előállítására és tisztítására többféle expressziós rendszert használnak. Ezek közé tartoznak az emlős, rovar, baktérium, növény, élesztő és sejtmentes expressziós rendszerek.
A fehérjeexpresszió általános stratégiája abból áll, hogy sejteket transzfektálunk a választott DNS-templettel, és hagyjuk, hogy ezek a sejtek átírják, lefordítsák és módosítsák a kívánt fehérjét. A módosított fehérjéket ezután a lizált sejtekből fehérjecímkék segítségével kivonhatjuk, és különböző tisztítási módszerekkel elválaszthatjuk a szennyeződésektől. Annak eldöntése, hogy melyik expressziós rendszert használja, több tényezőtől függ:
- Az expresszálni kívánt fehérje
- Milyen mennyiségű fehérjére van szüksége
- A downstream alkalmazásokkal kapcsolatos terveitől
Ebben a blogbejegyzésben összefoglalunk néhányat a leggyakoribb expressziós rendszerek közül, beleértve az előnyeiket és a fenntartásokat, amelyeket szem előtt kell tartani a rendszer kiválasztása előtt.
Az emlős kifejező rendszerek
Az emlőssejtek ideális rendszert jelentenek olyan emlős fehérjék kifejezésére, amelyeknek a megfelelő fehérjefunkcióhoz több poszttranszlációs módosításra van szükségük. A legtöbb emlősök expressziójára tervezett DNS-konstrukció vírusos promótereket (SV40, CMV és RSV) használ a transzfekció utáni robusztus expresszió érdekében. Az emlős rendszerek a fehérjéket mind tranziens módon, mind stabil sejtvonalakon keresztül képesek expresszálni. Mindkét módszer nagy fehérjehozamot eredményez, ha a transzfekció sikeres.
Néhány emlős rendszer lehetővé teszi annak szabályozását is, hogy mikor fejeződik ki egy fehérje, konstitutív és indukálható promóterek használatával. Az indukálható promóterek rendkívül hasznosak, ha a kívánt fehérjetermék nagy koncentrációban mérgező a sejtekre. Előnyeik ellenére az emlős expressziós rendszerek más rendszerekhez képest igényes sejttenyésztési körülményeket igényelnek.
Rovar expressziós rendszerek
A rovarsejtek is felhasználhatók komplex eukarióta fehérjék előállítására a megfelelő poszttranszlációs módosításokkal. Kétféle rovarkifejező rendszer létezik; baculovírussal fertőzött és nem baculovírussal fertőzött rovarsejtek.
A baculovírus expressziós rendszerek nagyon hatékonyak a magas szintű rekombináns fehérjék expressziójára. Ezek a rendszerek lehetővé teszik a nagyon összetett, glikozilált fehérjék magas szintű expresszióját, amelyeket E. coli vagy élesztő sejtekben nem lehet előállítani. A baculovírus rendszerek egyetlen problémája, hogy a fertőzött gazdasejt végül lizálódik. A sejtlízis leállítja a fehérjetermelést, de léteznek nem lízises rovarsejt-expressziós rendszerek (sf9, Sf21, Hi-5 sejtek), amelyek lehetővé teszik a rovarsejt genomjába integrált gének folyamatos expresszióját. Mindkét típusú rovar expressziós rendszer méretnövelhető nagy mennyiségű fehérje előállítására.
A rovarsejt expressziós rendszerek néhány hátránya közé tartozik, hogy a vírus előállítása meglehetősen időigényes lehet, és hogy a rovarsejtek az emlős expressziós rendszerekhez hasonlóan igényes tenyésztési körülményeket igényelnek.
Bakteriális expressziós rendszerek
Ha gyorsan és olcsón szeretnénk nagy mennyiségű fehérjét előállítani, szinte mindig a bakteriális gazdasejt a megoldás. Az E. coli minden bizonnyal az egyik legnépszerűbb gazdasejt a fehérjeexpresszióhoz, számos fehérjeexpresszióra specializálódott törzzsel. A baktériumokban történő fehérjeexpresszió meglehetősen egyszerű; a kívánt fehérjét kódoló DNS-t beillesztjük egy plazmid expressziós vektorba, amelyet aztán egy baktériumsejtbe transzformálunk. A transzformált sejtek szaporodnak, a kívánt fehérje előállítására indukálódnak, majd lizálódnak. A fehérje ezután tisztítható a sejttörmelékből.
Számos népszerű DNS-vektor létezik, amelyek nagy mennyiségű fehérje előállítására használhatók baktériumsejtekben: például a pET, pRSET, Gateway pDEST és pBAD vektorok. A fehérje expresszióját mindegyik vektorból más-más promóter vezérli, ami az egyes vektorok eltérő expressziós szintjét eredményezi; alacsonyabb expresszióra lehet szükség, ha a fehérje toxikus az E. coli számára. Az összes vektor közül a T7 lac promóter által vezérelt és laktózzal indukált pET biztosítja a legmagasabb szintű fehérjeexpressziót.
A könnyű használatuk ellenére fontos megjegyezni, hogy a baktériumok általában nem képesek funkcionális, több doménből álló emlős fehérjéket előállítani, mivel a baktériumsejtek nem rendelkeznek a megfelelő poszttranszlációs módosítások hozzáadására. Ráadásul sok baktérium által termelt fehérje oldhatatlanná válik, zárványtesteket képezve, amelyeket nehéz kivonni durva reagensek és türelem nélkül.
Növényi expressziós rendszerek
A növények olcsó és alacsony technológiai költségű eszközt biztosítanak a rekombináns fehérjék tömeges expressziójára. Számos, különböző típusú növényből, például kukoricából, dohányból, rizsből, cukornádból, sőt a burgonya gumóiból származó sejtet használtak fel fehérjeexpresszióra.
A növényi rendszerek számos olyan tulajdonsággal és feldolgozási követelménnyel rendelkeznek, mint az emlőssejtek expressziós rendszerei, beleértve a komplex poszttranszlációs módosítások többségét is. A rekombináns fehérjék növényekből történő kivonása és tisztítása azonban költséges és időigényes lehet, mivel maguk a növényi szövetek biokémiailag összetettek.
Ezek a problémák megkerülésére a tudósok a biokémiai anyagok és fehérjék természetes szekrécióját használták ki a növényi gyökereken keresztül. A rekombináns fehérjék jelölése egy természetesen szekretált növényi peptiddel lehetővé teszi a kívánt fehérje könnyebb hozzáférését és tisztítását. Annak ellenére, hogy meglehetősen kialakulóban lévő technológiáról van szó, a növényi sejteket fehérjék széles skálájának kifejezésére használták, beleértve az antitesteket és a gyógyszereket, különösen az interleukinokat.
A növényi sejtek kifejező rendszerei
A növényi sejtek kiváló kifejező rendszer rekombináns eukarióta fehérjék nagy mennyiségű előállítására. Bár számos élesztőfaj használható fehérjeexpresszióra, az S. cerevisiae, a legmegbízhatóbb és leggyakrabban használt faj, mivel a genetika és a biokémia modellorganizmusaként használják.
A S. cerevisiae használatakor a kutatók a rekombináns fehérjéket gyakran a galaktóz indukálható promóter (GAL) irányítása alá helyezik. Más gyakran használt promóterek közé tartozik a foszfát- és rézindukálható PHO5, illetve CUP1 promóter. Az élesztősejteket jól definiált táptalajon tenyésztik, és könnyen hozzáigazíthatók a fermentációhoz, ami lehetővé teszi a fehérjék nagyüzemi, stabil előállítását.
Az élesztő-expressziós rendszerekkel általában könnyebb és olcsóbb dolgozni, mint az emlős sejtekkel, és a bakteriális rendszerekkel ellentétben gyakran képesek komplex fehérjék módosítására. Az élesztősejtek azonban lassabban növekednek, mint a baktériumsejtek, és a tenyésztési körülményeket gyakran optimalizálni kell. Az élesztősejtek arról is ismertek, hogy hiperglikozilálják a fehérjéket, ami a választott fehérjétől függően problémát jelenthet.
Cellamentes expressziós rendszerek
A sejtmentes expressziós rendszerekben a fehérjéket in vitro állítják össze a transzkripciós és transzlációs gépezet tisztított komponenseinek felhasználásával. Ezek közé tartoznak a riboszómák, az RNS-polimeráz, a tRNS-ek, a ribonukleotidok és az aminosavak. A sejtmentes expressziós rendszerek ideálisak egynél több fehérje gyors összeállítására egy reakcióban. E rendszerek egyik fő előnye, hogy képesek a különböző downstream alkalmazásokban hasznos, jelölt vagy módosított aminosavakkal ellátott fehérjék összeállítására. A sejtmentes expressziós rendszerek azonban drágák és technikailag nagy kihívást jelentenek.
Alyssa D. Cecchetelli az Addgene tudományos munkatársa. PhD fokozatát a Northeastern University-n szerezte, és különösen a sejtszignálok és a kommunikáció érdekli. Imádja, hogy segíthet a tudományos közösségnek a plazmidok megosztásában.
Kiegészítő források
- Thermofisher Protein Expression Systems
- Rekombináns fehérjék expressziója Escherichia coliban: előrelépések és kihívások
- Rekombináns fehérjék előállítása növényi gyökér exudátumokban