“Géntechnológiának nevezzük azt a molekuláris genetikai technikát, amelyet a szervezetek génjeinek vagy genomjának közvetlen manipulálására, megváltoztatására vagy módosítására használnak a fenotípusok manipulálása érdekében.”

Vagy más szavakkal azt mondhatjuk:

“A géntechnológia olyan technika, amelynek segítségével egy szervezet genetikai összetétele megváltoztatható”.

A technikát gyakran nevezik genetikai manipulációnak, genetikai módosításnak vagy genetikai változtatásnak, tágabb értelemben a géntechnológia kategóriájába sorolják.

Ez a technika során rekombináns DNS-t állítanak elő, és egy vektor segítségével beillesztik a gazdaszervezet genomjába. Vagy törölhetünk néhány mutáns szekvenciát a genomból. Az első rekombináns DNS-t Paul Berg konstruálta 1972-ben.

A géntechnológiai technikával genetikailag módosított szervezeteket lehet létrehozni, amelyek gazdaságilag nagyon fontosak számunkra.

Ezt alkalmazzák továbbfejlesztett növényfajok, terápiás gyógyszerek vagy fehérjék előállítására, öröklött genetikai rendellenességek megelőzésére és genetikailag módosított szervezet létrehozására.

A jelen cikkben fő témánk a géntechnológia és annak alkalmazásai. A cikk tartalma a következő,

• Mi a géntechnológia
  • Definíció
  • Történet
  • Típusok
  • Folyamat

A géntechnológia alkalmazása

A géntechnológia korlátai

Végkövetkeztetés

Az ember már régóta manipulálja számos szervezet genetikai anyagát. Szelektív nemesítéssel és kereszthibridizációval gazdaságilag fontos növényfajokat hoztunk létre.

A géntechnológia vagy génmanipulációs technika kifejlesztésének célja, hogy számunkra hasznos szervezeteket vagy fenotípusokat hozzunk létre. A géntechnológiai technikákat használják,

• Génmódosított növényfajok előállítására.
• Abiotikus és biotikus stressznek ellenálló növényfajok előállítására.
• Gazdasági szempontból fontos növényfajok
• Kereskedelmi szempontból értékes szervezet
• Terápiás gyógyszerek előállítására
• Génrendellenességek megelőzésére.

“A géntechnológia során két különböző sejt DNS-ét egyesítik és vektoron keresztül beillesztik a gazdagenomba.” A génmanipulációs kísérletek fontos összetevőit ismertetjük itt.

Kérdéses gén: Egy DNS-szekvencia, amelyet be akarunk illeszteni a célsejtjeinkbe.

Vektor: A plazmid DNS-hez hasonló vektorok segítségével a kívánt gént beillesztjük a gazdagenomba. A vektorok egyfajta hordozók, amelyek a genetikai anyagot továbbítják.

Célsejtek: A célsejtek azok a sejtpopulációk, amelyek genomját manipulálni vagy megváltoztatni kívánjuk.

Definíciók:

“A mutáns gén beillesztésére vagy törlésére, illetve egy szervezet genomjának manipulálására használt technikát nevezzük géntechnológiának.”

A géntechnológia története:

A géntechnológia kifejezést először egy sci-fi regényíró használta, nem pedig egy tudós. Az 1951-es évben Jack Williamson használta először a géntechnológia kifejezést a “Sárkánysziget” című regényében.

Nem sokkal később Watson és Crick felfedezte a DNS molekuláris szerkezetét, bár a genetikai kísérletek már Mendel óta népszerűek voltak.

Az első rekombináns DNS-t Paul Berg állította elő 1972-ben. Ugyanebben az évben Herbert Boyer és Stanley Cohen génátviteli kísérleteket végzett. Rudolf Jaenisch 1974-ben hozott létre genetikailag módosított egereket, a genetika történetében először.

Rudolf sikere után 1976-ban kifejlesztették a genetikailag módosított vagy genetikailag módosított dohány növényfajt.

Ebben az időszakban (1960 és 1990 között) fedezték fel a restrikciós emésztési, ligációs és PCR-szerű technikákat, amelyek szárnyakat adtak a géntechnológiai technológiának.

Kapcsolódó cikk:

A géntechnológiai technikák fajtái:

Rekombináns DNS- A rekombináns DNS-technológia a géntechnológia egyik típusa, amelyben két különböző DNS fizikai módszerekkel történő ligálásával mesterséges DNS-molekulát állítanak elő. Ehhez a kívánt gént beillesztik a plazmidvektorba, és géntranszfer-kísérletekhez használják.

Génszállító- A génszállító technikát az érdeklődésre számot tartó génnek a gazdagenomba történő beillesztésére alkalmazzák.

Elektroforáció, kérés és vírusvektorok által közvetített géntranszfer, liposzómák által közvetített géntranszfer, transzpozonok által közvetített géntranszfer néhány az erre használt módszerek közül.

Génszerkesztés- A génszerkesztési technikát a genom szerkesztésére használják, amelynek során egy nem kívánt DNS-szekvenciát eltávolítanak, vagy egy új gént illesztenek be a gazdagenomba. A CRISPR-CAS9, a TALEN és a ZFN néhány ismert génszerkesztő eszköz, amelyeket génterápiás kísérletekben használnak.

Bővebben: Mi az a génszerkesztés és a CRISPR-CAS9?

A géntechnológia folyamata:

A géntechnológiát sokféle célra használják, ezért először el kell döntenünk, hogy mi a kísérlet célja. A géntechnológia teljes folyamata 5 nagyobb lépésre osztható:

• A jelölt gén kiválasztása és izolálása
• A plazmid kiválasztása és megépítése
• Géntranszformáció
• A DNS beillesztése a gazdagenomba
• A beillesztés megerősítése

A jelölt gén kiválasztása és izolálása:

A génnek olyan DNS-szekvenciát kell tartalmaznia, amelyet vizsgálni akarunk, és ehhez a génnek van néhány különleges tulajdonsága. A jelölt génnek magas GC-tartalommal és alacsonyabb repetitív DNS-szekvenciával kell rendelkeznie.

Ezeken kívül az érdeklődésre számot tartó gén nem lehet túl hosszú – csak néhány kb-os géneket lehet sikeresen beilleszteni. Minél hosszabb a gén, annál nagyobb a sikertelenség esélye. A jelölt génnek rendelkeznie kell start és stop kodonnal. Kapcsolódó cikk:

Az érdeklődésre számot tartó gént most már el lehet különíteni a DNS többi részétől restrikciós emésztéssel vagy polimeráz láncreakcióval.

A restrikciós endonukleázok azok a bakteriális enzimek, amelyek képesek a DNS-szekvenciát egy adott helyen megemészteni. Egy adott típusú restrikciós endonukleáz segítségével vághatjuk és izolálhatjuk a minket érdeklő gént.

A restrikciós emésztés módszerét korábbi cikkünkben ismertettük: Mi a restrikciós emésztés?

A polimeráz láncreakcióban a génszekvencia információit felhasználva a termociklálóban felszaporítjuk a kívánt gént vagy a jelölt gént.

A gép a polimeráz láncreakció segítségével több millió másolatot készít a minket érdeklő génből. Az agarózgél-elektroforézis folyamatán keresztül izoláljuk az amplifikált gént.

Ha a minket érdeklő gént jól tanulmányozták, korábban, akkor a génkönyvtárban hozzáférhető a gén információja, és felhasználhatjuk az általunk kívánt gén mesterséges szintéziséhez. (a génkönyvtári információt felhasználva a gén mesterségesen is szintetizálható)

A következő lépésben végezzük el a DNS-tisztítást, ha szükséges. Most már készen áll a DNS-ünk a plazmidba való beillesztésre.

Szelekció és a plazmid megépítése:

A plazmid kiválasztása a géntechnológiai kísérlethez az egyik legfontosabb lépés az egész kísérletben. A plazmid kiválasztása előtt meg kell értenünk, hogy miért használjuk a plazmidot a génátviteli kísérletekben.

A plazmid DNS a baktériumok körkörös, kettős szálú citoplazmatikus DNS-e, amely önállóan szaporodik.

A tudósok hordozóként használják a kívánt génnek a genomban lévő célhelyre történő átvitelére. Hatékonyan képes a gént a célhelyre átvinni. A plazmid szerkezetét az alábbi ábra mutatja be,

Kapcsolódó cikk:

A plazmid előállítása:

Válassza ki a kísérletének megfelelő plazmidot.

A plazmidnak rendelkeznie kell a replikációs origóval, a promóter régióval, az antibiotikum-rezisztencia génnel és más fontos szekvenciákkal. A restrikciós emésztés módszerével egy inszerciós helyet viszünk be a plazmidba, ahová a minket érdeklő gént ligáljuk.

A T4 DNS-ligáz, mint power sealer felhasználásával a plazmidba illesztjük és ligáljuk a minket érdeklő DNS-t. A plazmiddal együtt egy szelektálható markert is beviszünk a plazmid DNS-be a rekombináns DNS azonosítására.

Ezeken kívül egy promóter régió és terminátor szekvenciák is szerepelnek a plazmidban a minket érdeklő gén hatékony kifejeződése érdekében. A minket érdeklő gént és néhány más fontos szekvenciát tartalmazó plazmidot most rekombináns DNS-molekulának nevezzük.

Most a rekombináns DNS-ünk készen áll az expresszióra.

Ha génklónozást végzünk, akkor a plazmidot beillesztjük a bakteriális gazdaszervezetbe, erre általában az E.Coli-t használják. Amint a baktérium osztódni kezd, a rekombináns plazmid DNS-ünk is vele együtt replikálódik.

Most már rendelkezünk a plazmid DNS-ünk többszörös másolatával, amelyet a plazmid DNS extrakciós készlet segítségével extrahálunk és felhasználunk a transzformációs kísérletekhez.

Transzformáció a gazdagenomba:

A rekombináns DNS átvitele a recipiens sejtbe vagy a gazdagenomba egy újabb fáradságos és nehéz feladat. A rekombináns DNS bevitelére különböző módszereket alkalmaznak különböző sejttípusok esetében, mivel egyetlen módszer nem használható minden sejttípusra.

Különböző módszerek a transzformációhoz:

Stressz alkalmazása – a baktériumok könnyen felveszik a plazmid DNS-t bizonyos stresszfaktorok, például hő vagy elektromos zokni segítségével.

Mikroinjekció- egy éles tűt használnak a DNS közvetlenül a sejtmagba történő bejuttatására, azonban a módszer kevésbé hatékony és nagyobb szakértelmet igényel hozzá.

Elektroporáció- az egyik legjobb, nagy sikerességi aránnyal rendelkező módszer az elektroforációs módszer, amelyben a rekombináns DNS-t a sejt elektromos árammal történő permeabilizálásával juttatják be a gazdasejt genomjába.

Erről egy egész cikket írtunk. Olvassa el itt: Electroporation- A Modern Gene Transfer Technique.

Sonication- a szonikáció még egy jó módszer, amelyet néha használnak a géntranszfer kísérletben, amelyben a rekombináns DNS-t ultrahanghullámok segítségével juttatják be a célsejtbe. Az ultrahangos hullámok a sejtek áteresztőképességét is növelik.

Liposzóma közvetítésű géntranszfer- egy mesterséges sejtszerű külső burkolat, az úgynevezett liposzóma segítségével – rekombináns DNS-t lehet beilleszteni a gazdaszervezet genomjába.

Génátvitel bakteriális fertőzéssel- Ez a módszer az egyik legnépszerűbb módszer, és rutinszerűen alkalmazzák a növényi géntechnológiai kísérletekben. Itt a növényfajt transzformált baktériummal fertőzik meg a kívánt gén beillesztése céljából.

Agrobacterium tumifecian-t használnak a rekombináns DNS növényi sejtbe történő beillesztésére. A kívánt gént az Agrobacterium Ti-plazmidjába illesztik be. A növényi sejteket ezzel a baktériumsejtkultúrával fertőzik meg, és a transzformált sejteket a növényi szövettenyésztési módszerekkel regenerálják.

Kémiai a génátvitelben- A génátviteli kísérletekben néhány fémiont, vegyszert és különböző vegyszerek oldatait is alkalmazzák, azonban a sikerességi arány túl alacsony a többi módszerhez képest.

Az inszert megerősítése:

Munkánk még mindig nem fejeződött be.

Most meg kell felelnünk annak, hogy a rekombináns DNS beilleszkedik-e a célsejtünkbe vagy sem. Ehhez különböző molekuláris genetikai technológiákat használunk. A hagyományos tenyésztési módszerben egy szelektálható marker jelenlétét vagy hiányát használják a transzformált sejtek megkülönböztetésére a nem transzformált sejtektől.

A PCR-alapú kimutatási módszernél azonban erre nincs szükség. A polimeráz láncreakción alapuló kimutatási módszer széles körben elfogadott, megbízhatóbb, mint más módszerek.

A transzformált sejtből DNS-t vonunk ki, és a kívánt génünkhöz vagy a rekombináns DNS-ünkhöz komplementer primerekkel amplifikáljuk.

Ha a rekombináns DNS jelen van, akkor biztosan amplifikálódik, ellenkező esetben nem kapunk amplifikációt. A kétfaktoros konformációhoz egy, a rekombináns DNS-specifikus és egy, a szelektálható marker szekvenciához komplementer primer készletet veszünk, és multiplex PCR-t végzünk.

Az eredmények validálásához mindkét reakcióban amplifikációt kell elérni.

De várjunk csak egy percet!

Mi történik, ha a kísérlet során mutáció következik be az érdeklődésünkre számot tartó génünkben? Mert a PCR csak a DNS-t tudja felerősíteni. A mutáció kimutatásához szekvenciainformációra van szükségünk.

Ezért a DNS-szekvenálási módszert használjuk.

A transzformált sejtekből DNS-t vonunk ki, és a PCR segítségével felerősítjük a kívánt gént. Ezután a PCR amplikonokat DNS-szekvenálásra használjuk, amelyben a fluoreszcens kémia segítségével rendre meghatározzuk a minket érdeklő gén szekvenciáját.

Mihelyt a kívánt gén meghatározásához szükséges összes paraméter teljesült, sejtjeink már készen állnak a gazdaszervezetbe történő befecskendezésre vagy szövettenyésztési kísérletekre.

A géntechnológia alkalmazásai:

Most elérkeztünk a téma fontos pontjához: “Mire használják a géntechnológiát?”

A géntechnológia nagy ipari és mezőgazdasági értékkel bír. Gyakorolják az orvostudományban, a genetikai kutatásban, a mezőgazdaságban, a növénytermesztésben és a terápiás gyógyszerek előállítására.

A genetikailag módosított szervezetek kifejlesztésében is alkalmazzák. Itt a géntechnológia néhány fontos alkalmazását tárgyaljuk.

A rekombináns DNS-technológiát a növénytermesztésben és új, gazdaságilag fontos tulajdonságok kifejlesztésében használják. Néhány ezek közül:

• Herbicidrezisztencia
• Vírusrezisztencia
• Késleltetett gyümölcsérés
• Változott olajtartalom
• Pollenszabályozás
• Fagy- és szárazságtűrő növényfajok kifejlesztése.

Klasszikus példa erre a BT gyapot – a genetikailag módosított fajok egyik fajtája a bacillus thuringiensis baktériummal szemben biztosítja a növény rezisztenciáját.

A genetikailag módosított növényfajok kifejlesztésének folyamata:

A szervezetből restrikciós emésztéssel izolálják a kívánt gént, vagy polimeráz láncreakcióval amplifikálják. A rekombináns DNS-t az érdeklődésre számot tartó gén plazmidba történő beillesztésével állítják elő, itt a T-plazmidot használják.

A következő lépésben a T- plazmidot beillesztjük az agrobaktériumba. Az utolsó lépésben a növényfajt megfertőzik a transzformált baktériumsejtekkel és tenyésztik. A teljes folyamatot az alábbi ábra mutatja

GMF- a géntechnológiával módosított élelmiszer a géntechnológia másik legjobb alkalmazása, amelyben gazdaságilag fontos élelmiszereket állítanak elő rekombináns DNS technológia segítségével.

Klasszikus példa erre a Flavr Savr paradicsom, az antisense RNS technológiával előállított genetikailag módosított paradicsomfajta. Nagy gazdasági értékkel bír, mivel a GM-paradicsom könnyen szállítható egyik helyről a másikra.

A géntechnológia másik fontos alkalmazása a genetikailag módosított vagy genetikailag módosított élelmiszer.

A jelenlegi rekombináns DNS-technológia segítségével egyes élelmiszerek, például a gyapot, a kukorica és a szójabab minőségét javítják. A genetikailag módosított növények vagy növényfajok kifejlesztésének célja, hogy gazdaságilag fontos, tápláló, fehérjében gazdag, betegségekkel és stresszel szemben ellenállóvá tegyék őket.

Sőt, géntechnológiai és szövettenyésztési technikák alkalmazásával rovarölőszerekkel szemben rezisztens növényfajokat fejlesztenek ki dohányban, burgonyában, kukoricában és gyapotban.

Ezeken kívül a jelenlegi génmódosítási technikával néhány olyan módosított növény is létrehozható, amely képes saját műtrágyát előállítani.

Transzgenikus modellorganizmusokat fejlesztenek ki különböző paraméterek vizsgálatára – bizonyos gének funkciója meghatározható a transzgenikus mikroorganizmusok és állatmodellek kialakításával.

Káros kórokozók és rovarölő paszták elpusztíthatók olyan genetikailag módosított mikroorganizmusokkal, amelyek képesek a toxikus anyagok lebontására.

Medicinális alkalmazások:

Géntechnológiai eszközökkel olcsó gyógyszerek, hormonok, enzimek és vakcinák hozhatók létre.

A véralvadásgátló faktor a legjobb példa erre, amelyben a vérrögöt feloldani képes plazminogént aktiváló enzimet mesterségesen tervezik és alkalmazzák a koszorúér-betegségben vagy szívinfarktusban szenvedő betegeknél.

A másik példa két másik terápiás fehérje a szomatosztatin és a limfokinek, amelyek számos betegség ellen hatnak, és mesterségesen szintetizálhatók. Az inzulin még egy klasszikus példa a géntechnológiával tervezett terápiás fehérjére.

Az inzulin génjét restrikciós emésztéssel vagy PCR segítségével izolálják, és beillesztik a plazmidba. A rekombináns plazmid DNS-t azonnal beillesztik abba a baktérium- vagy élesztősejtbe, amelyben a plazmid szaporodik. Ahogy a mikroorganizmus osztódni kezd, mesterséges inzulint kezd gyártani.

Ezzel a technikával nagy mennyiségű inzulint állítanak elő ipari méretekben. Az inzulin előállításának részletes vázlata az alábbi ábrán látható:

Az FDA 1982-es jóváhagyása után kezdődött meg az inzulin kereskedelmi célú előállítása.

Rekombináns vakcinák:

A himlő, a herpes simplex vírus és a hepatitis elleni oltóanyagokat géntechnológiai technikával állítják elő. A vakcinák inaktivált vírusrészecskék, amelyeket az adott kórokozó elleni immunválasz kiváltására használnak, azonban nagy benne a kontamináció esélye.

A rekombináns DNS-technológia alkalmazásával a tudósok olyan egyedülálló oltóanyagtípust hoztak létre, amely csak a vírus burkolófehérje DNS-ét tartalmazza, így a kórokozó soha többé nem aktiválható. Ennek legfőbb előnye, hogy biztonságosabb, szennyeződésmentes és reaktívabb.

Géntechnológia a génterápiában:

A génterápia vagy géntranszfer technika alkalmazásával gyógyíthatóak az öröklött genetikai rendellenességek. A cisztás fibrózis, a Duchenne-izomdisztrófia és a sarlósejtes vérszegénységhez hasonló génterápiák már a végső klinikai vizsgálati fázisban vannak, és készen állnak a betegeken való alkalmazásra.

A génterápiában a hibás, nem működő vagy mutálódott gént a vad típusúval helyettesítik a fent ismertetett technikával.

A génterápiáról elképesztő cikkeket írtunk, olvassa el itt:

1. Génterápia:
2. Mi a génterápia és hogyan működik?
3. Naked DNA Mediated Gene Therapy
4. Sleeping Beauty Transposon System: A génterápia jövője

Ezen kívül a géntechnológiát hasonlóképpen alkalmazzák a bioüzemanyag, a betegségek, a bioalkohol és más alapvető termékek előállításában.

A géntechnológia korlátai:

A génterápia és a géntechnológiával előállított termékek alkalmazásával kapcsolatban etikai kérdések merülnek fel.

Az élelmiszer vagy bármely génmódosított termék gazdasági értékének biztosítása érdekében a táplálkozási értékek is sérülnek.

A káros hatás miatt gyorsabban fejlődnek ki új rezisztens kórokozó törzsek.

A génterápia mellékhatásai és a vírusok használata benne szintén káros a célszervezetre.

A technológia költségesebb, mivel a génterápia akár 50 000 dollárba is kerülhet.

Következtetés:

Az embrióval vagy magzattal való játék ellenkezik a természetjoggal, az emberek erősen hisznek benne, ezért a genetikailag módosított élelmiszerek és növényi termékek mindig viták középpontjába kerülnek.

A géntechnológiai eszközök, például a génterápia és a génátviteli technika segítségével azonban megelőzhetők az örökletes rendellenességek és a rákhoz hasonló halálos betegségek. A géntechnológiai technikák pozitív alkalmazása megváltoztathatja az emberiség sorsát.

Források:

1. National Research Council (US) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health. A géntechnológiával módosított élelmiszerek biztonsága: Approaches to Assessing Unintended Health Effects (megközelítések a nem szándékolt egészségügyi hatások értékeléséhez). Washington (DC): National Academies Press (USA); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms.
2. Wallace RB. A génmanipuláció alapelvei. Bevezetés a géntechnológiába. Tanulmányok a mikrobiológiában. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.