K knockout egerek előállítása

A knockout egerek előállítására használt technológiák közé tartozik a homológ rekombináció (vagy géncélzás) és a géncsapdázás. Mindkét megközelítés egér embrionális őssejtek (ES-sejtek) felhasználásával történik, amelyeket a megtermékenyítést követő négy napon belül izolálnak egérembriókból. Az első megközelítésben, a homológ rekombinációban a célgén DNS-szekvenciája előtt és után előforduló szekvenciákkal homológ (azonos) szekvenciákkal rendelkező mesterséges DNS-t juttatnak be egy egér ES-sejt magjába. Az ES-sejt felismeri a homológ kísérőszekvenciákat és kicseréli a meglévő célgén DNS-t az idegen DNS szakaszaira. Az idegen DNS azonban inaktív. Így az ES-sejt genomjába való beépülése inaktiválja, vagy kiiktatja a célgént. Az idegen DNS-t általában úgy alakítják ki, hogy egy riportergént hordozzon, amely jelzi vagy megjelöli a meglévő gén helyét, így a kutatók nyomon követhetik annak jelenlétét az egérsejt genomjában, ahogy a sejtek szaporodnak. A homológ rekombináció a választott módszer, amikor egy adott allélt (gént) egy módosított DNS-szekvenciával kell helyettesíteni anélkül, hogy a genom más génjeit befolyásolná.

A géncsapdázás szintén mesterséges DNS-t használ, amely riportergént hordoz. Azonban ahelyett, hogy egy adott gént céloznának meg, az idegen DNS-t véletlenszerűen beépítik az egér ES-sejt genomjának bármely génjébe. Az idegen szekvencia megakadályozza, hogy a megzavart gén kódolja fehérjetermékeit, ezáltal a gén inaktívvá válik. A riportergén aktiválódása az ES-sejt genomjába való beépülést követően lehetővé teszi a kutatók számára a génaktivitás nyomon követését és a megzavart gén funkciójának megállapítását.

A mesterséges DNS-szekvenciákat általában retrovírus vagy más vírusvektor segítségével juttatják be egér ES-sejtekbe, majd a módosított ES-sejteket sejtkultúrákban tenyésztik. Néhány nap múlva a sejteket korai egérembriókba fecskendezik, amelyeket ezt követően beültetnek egy béranya méhébe, ahol végül kifejlődnek és kihordják őket. Az így született egérkölykök tartalmaznak módosított és nem módosított szöveteket is, így nem teljes mértékben knockout egerek. Ahhoz, hogy valódi knockout egereket (homológ knockout egereket) hozzanak létre, az egereket több generáción keresztül kell tenyészteni. Kezdetben az állatokat más egerekkel keresztezik, hogy heterozigóta egyedeket (a célgén egy példányával rendelkező egereket) hozzanak létre; a heterozigóta egyedeket ezután egymással keresztezik, hogy homozigótákat hozzanak létre.