Cellkultúra reagensek

A Human Akt1 ORF glicerin állományát pENTR221 vektor formájában a GE Dharmacon-tól kaptuk (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). Az SH Tag-et tartalmazó módosított célvektor (pcDNS/FRT/TO) Dr. Matthias Gstaiger (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zürich, Zürich, Svájc) nagylelkű ajándéka volt. Az Flp-In TREx HEK293 sejtek (#R780-07), LR Clonase II enzimkeverék (#11791-100), pOG44 vektor (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) és Dynabeads Protein A (#100.02D) az Invitrogen-től származott. Az Xtremegene 9 (#06365787001) a Roche-tól származik. A DMEM (#12430-054) és az RPMI 1640 (#22400-089) a GIBCO-tól származik. A tripszint (#CC5027.010L) a Genetics-től szereztük be. A normál FBS-t (#SH30070.03), valamint a Tet-szűrésű FBS-t (#SH30070.03T) a Hyclone-tól szereztük be. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazol (#M1404-10MG), Propidium-jodid (#P4170-250 mg) és Lys C proteáz (#P3428) a Sigmától származott. A SILAC-címkéket a Cambridge Isotope Laboratories, Inc. A proteáz inhibitor koktélt (100X) (#78429) és a Pierce anti-HA agaróz gyöngyöket (#26182) a Thermo Scientific-től szereztük be. A MagStrep “Type 2HC” gyöngyöket (#2-1612-002) az IBA BioTagnology-tól kaptuk. A Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, India szintetizálta a HA peptidet. A nitrocellulóz membránt (#RPN303E) a GE Healthcare-től vásároltuk. A tripszin proteázt (#4370282) az AB Sciextől szereztük be. A teljes körű szivárványfehérje molekulatömeg marker (#RPN800E) az Amershamtől származott. siRNS-eket, Dharmafect transzfekciós reagens (#T-2001-03), RNázmentes víz (#B-003000-WB-100), 5X siRNS puffer (#B-002000-UB-100) a Dharmacon-tól kaptuk. Az RNáz A (#19101) a Qiagen cégtől származott.

A Western Blothoz használt ellenanyagok

A jelen vizsgálatban használt ellenanyagok a következők voltak: anti-HA (#SC-7392; egér monoklonális, hígítás 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; egér monoklonális, hígítás 1:1000) és anti-GAPDH (#SC-25778; nyúl poliklonális, hígítás 1:1000) a Santa Cruz-tól; anti-CDC2 (#77055; nyúl poliklonális, hígítás 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; nyúl poliklonális, hígítás 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; nyúl poliklonális, hígítás 1:1000) a Cell Signalling Technology-tól; anti-BUB3 (#ab133699; nyúl monoklonális, hígítás 1:10000); anti-API5 (#ab56392; egér monoklonális, hígítás 1:1000) és anti-SH3PX1 (#EPR14399; nyúl monoklonális, hígítás 1:2000) az Abcam-tól; a másodlagos antitesteket a Licor Biosciences-Odyssey kecske anti egér (#926-32210, hígítás 1:15000) és Odyssey kecske anti nyúl (#926-32211, hígítás 1:15000) cégektől szereztük be.

Staabil sejtvonal előállítása

Ebben a vizsgálatban gateway kompatibilis Akt1 belépési vektort (pENTR221) használtunk egy expressziós konstrukció létrehozására LR rekombinációs reakcióval egy megfelelő célvektor (pcDNS/FRT/TO) jelenlétében. A célvektort úgy módosítottuk, hogy Strep-HA (SH) tag-et tartalmazzon, amely egy streptavidin-kötő peptidet (Strep) és egy hemagglutinin (HA) epitóp tag-et tartalmaz. Ezt az SH tag-et végül arra használtuk, hogy szelektíven kihúzzuk az Akt1-et és interakciós partnereit komplex sejtlizátumokból. Egy indukálható Akt1-expressziós sejtvonal létrehozásához az expressziós konstrukciót pOG44 rekombinázzal együtt transzfektáltuk Flp-In TREx HEK293 sejtekbe, stabilan expresszálva a Tet represszort. A transzfekciót Xtremegene 9 transzfekciós reagenssel könnyítettük meg. Az Akt1 konstrukciót expresszáló sejteket 15-20 napon keresztül szelektáltuk hígromicin-B (75 µg/ml) tartalmú RPMI tápfolyadékban, amelyet 10% Tet-szűrt FBS-szel egészítettünk ki. Ezeket a szelektált sejteket később összevontuk, hogy a pulldown kísérletekhez bővítsük őket.

Az optimális Akt1-expresszióhoz szükséges Tet-koncentrációt úgy határoztuk meg, hogy az Akt1-expressziót a Tet-koncentrációk tartományában (0,1 µg/ml és 5 µg/ml között) indukáltuk, és az Akt1 fehérjeexpressziós szintjét Tet jelenlétében és hiányában anti-Akt1, valamint anti-HA antitest használatával követtük nyomon. A Tet-et 24 óránként kiegészítettük a táptalajjal, hogy fenntartsuk az Akt stabil expresszióját.

PDT kísérlet

PDT HEK293 sejteknél a normál és Akt1-overexpresszáló sejteknél a Tet kezdeti beadása után 72 órán keresztül követtük nyomon. Minden megfigyelési ponthoz 104 normál és Akt1-overexpresszáló HEK293 sejtből álló párhuzamos sorozatot vetettünk ki három példányban, 96 lyukú lemezbe, 100 µl DMEM médiában, amely 10% szérumot tartalmazott. A vetés után 24 órával Tet-et adtunk a táptalajhoz, majd egy újabb 24 órás inkubációs intervallum után a sejteket 0. időpontként szedtük le. Ezt követően a párhuzamos tenyésztésben lévő sejtek egy csoportját 24 óránként szedtük le 72 óráig. A PDT-t úgy határoztuk meg, hogy minden egyes időpontban megszámoltuk a sejteket trypan-kék festési módszerrel.

SILAC-jelölés a sejtciklusfázis-specifikus Akt1 interaktom megkülönböztetésére

Akt1-overexpresszáló HEK293 sejteket bővítettük és a lizin (K) és arginin (R) “könnyű” (K0R0), “közepes” (K6R6) vagy “nehéz” (K8R10) izotópjait tartalmazó SILAC-közegben tenyésztettük legalább 5 sejtduplázódásig, hogy a jelölés teljes beépülhessen. 70%-os konfluencia esetén Tet-et (1 µg/ml) adtunk a médiumhoz az Akt1 expresszió indukálása érdekében. A K0R0 címkézett sejteket egy éjszakán át tartó széruméhséggel G0 fázisban tartottuk, ami egy széles körben használt módszer a sejtek G0 fázisban való tartására42. Ehhez a normál teljes táptalajt szérumhiányos RPMI-vel helyettesítettük, és a sejteket 16-18 órán keresztül 37 °C-on, 5%-os CO2-koncentrációban tartottuk a tenyészetben. A K8R10-cel jelölt sejteket G1/S fázisban tartóztattuk le úgy, hogy a sejteket egy éjszakán át 5 µg/ml afidikolin jelenlétében tenyésztettük; ez az eukarióta nukleáris DNS-replikáció reverzibilis inhibitora43. Hasonlóképpen, a G2-fázisban való leállításhoz 400ng/ml nokodazolt adtunk a K6R6-mal jelölt sejtek táptalajához, és az inkubációt 16-18 órán keresztül folytattuk, mielőtt a sejteket pelletáltuk. A nokodazol megzavarja a mikrotubulusok polimerizációját, ezáltal a sejteket a G2/M fázisban tartóztatja le44. A letartóztatott sejteket tripszinizáltuk és külön-külön megszámoltuk trypan-kék festési módszerrel. A különböző sejtciklusfázisokban leállított sejteket ezután 10 percig 1500 rpm-en történő centrifugálással pelletáltuk. Minden egyes sejtciklusfázishoz több sejtpelletet készítettünk, és felhasználásig -80 °C-on tároltuk.

SH-tagged Affinity Purification

A G0, G1/S és G2 fázisokban letartóztatott Akt1-overexpresszáló sejteket 1:1:1 arányban összekevertük, és 1 órán át jégen lizáltuk IP-pufferben (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1% NP-40; 1X proteáz inhibitor koktél és 1 mM PMSF). A sejtlizátumot a törmelékektől megtisztítottuk, miután 4 °C-on 15 percig 10 000 fordulat/perc fordulatszámon centrifugáltuk. Az Akt1 fehérjekomplexeket párhuzamos sorozatokban szelektíven tisztítottuk Strep és HA tag egyidejű célzásával, a megfelelő készletek használati utasításai szerint. Röviden, a strep-tagolt Akt1 fehérjekomplexeket 100 µl streptaktin mágneses gyöngyökkel kevertük össze, és 1 órán át tartottuk 4 °C-on, forgó rázógépen inkubálva. Az esetleges nem specifikus interaktort öt egymást követő mosási lépés során öt térfogatnyi streptaktin mosópufferrel mostuk le. Az Akt1 fehérjét és interaktorait végül két elúciós lépésben eluáltuk elúciónként 125 µl strep elúciós pufferrel (invitrogen). A HA-jelölt Akt1 fehérje komplexek tisztításához a megtisztított sejtlizátumokat 50 µl előmosott HA agaróz gyöngyökkel inkubáltuk 2 órán keresztül 4 °C-on, rotációs rázógépen. Három gyors mosás után, tíz gyöngytérfogatnyi TBS-T pufferrel, az Akt1 fehérjekomplexeket háromszor eluáltuk 50 µl HA peptiddel (250 µg/ml). A fenti tisztítási lépéseket három ilyen biológiai ismétlésen végeztük el az Akt1 fehérje és interakciós partnereinek tisztítására, majd az egyes ismétlések Strep és HA eluátumait összevontuk, liofilizáltuk és -80 °C-on tároltuk a további feldolgozásig.

Fehérjeemésztés és mintaelőkészítés az LC-MS/MS-hez

A fehérjeemésztést mindhárom biológiai ismétlésben külön-külön végeztük el. A liofilizált mintához 40 µl 100 mM ammónium-bikarbonátot adtunk, jól elkevertük, majd 2 µl denaturáló puffert (AB Sciex) adtunk hozzá. A mintákat 4 µl redukáló reagenssel (AB Sciex) redukáltuk 1 órán keresztül 60 °C-on. A redukált ciszteinmaradványok blokkolásához 2 µl cisztein blokkoló reagens hozzáadásával 10 percig szobahőmérsékleten tartottuk. A fehérjeemésztést 5 µl 0,1 µg/µl Lys C endo-proteináz hozzáadásával indítottuk el. A mintákat 4 órán át 37 °C-os vízfürdőben inkubáltuk. Rövid forgatás után 1 µl tripszint (1 µg/µl) adtunk a mintákhoz, és további 12-16 órán át inkubáltuk 37 °C-on. A fehérjeemésztést egy csepp hangyasav (FA) hozzáadásával fejeztük be.

A savasított mintákat liofilizáltuk, majd monospin C-18 oszlopok segítségével peptidtisztításnak vetettük alá. Használat előtt a C-18 oszlopokat metanollal és vízzel kondicionáltuk, majd tovább egyensúlyoztuk 3% ACN 0,1%-os FA-val. A liofilizált mintákat 3% ACN-ben 0,1% FA-ban oldottuk fel, majd a C-18 oszlopokra töltöttük, és 10 percig hagytuk kötődni. A minták kétszer mentek át az oszlopokon a teljes kötődés biztosítása érdekében. Tíz szigorú mosás után 3% ACN 0,1%-os FA-val, az emésztett peptideket először 40% ACN-ben eluáltuk, majd két elúciót végeztünk 60% ACN-ben. Végül a három eluátumot összevontuk és liofilizáltuk, minden egyes ismétléshez.

A kioldott peptideket újra feloldottuk 500 µl 5 mM ammónium-formiátban (pH 2,5) 30%-os ACN-ben és óvatosan vortexeltük. A minta betöltése előtt a kationcserélő patront fixáltuk és kondicionáltuk. A minta betöltését követően a patront háromszor mostuk 5 mM ammóniumformiáttal (1 ml). A peptideket elúciónként kétszer 400 µl 500 mM ammónium-formiát (pH 2,5) 30%-os ACN-ben történő ismételt eluálásával eluáltuk, majd az eluátumokat minden mintaismétléshez összevontuk és liofilizáltuk.

Masszaspektrometriás kísérlettervezés és statisztikai indoklás

LC-MS/MS analízis

Minden mintát nano-flow folyadékkromatográfiával elemeztünk egy nanoflex rendszeren (Eksigent Technologies, AB Sciex), amelyhez egy tripla TOF 5600 tömegspektrométer (AB Sciex; Concord, Kanada) csatlakozott. Minden biológiai ismétlést kétszer injektáltunk technikai ismétlésként. A rendszer bináris fázisú gradienst használt, A oldószerrel (2% ACN 0,1% FA-ban) és B oldószerrel (98% ACN 0,1% FA-ban). Az optimális mintaadagolás reprodukálhatósága érdekében az automatikus mintavevő készüléket teljes injektálási módban működtettük, 3 µl mintával túltöltve az 1 µl-es hurkot. Az egyes mintainjekciók méréseihez a peptideket cHiPLC csapdán, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent), csapdáztuk és cHiPLC oszlopon, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) 300 nl/perc áramlási sebességgel, lineáris gradiens alkalmazásával választottuk szét: 5-60% B oldószer 80 perc alatt, 60-90% 2 percig. Az oszlopot 90%-os B oldószerrel 6 percig történő mosással regeneráltuk, majd 5%-os B oldószerrel 22 percig újrakiegyenlítettük.

A tömegspektrométert Nano Spray ionforrással (AB Sciex) kapcsoltuk, amelyet Analyst szoftver (v.1.6) vezérelt. Az ionforrást 10 μm-es SilicaTip elektrospray PicoTip emitterrel (AB Sciex) szereltük fel, és az eluált peptideket a következő ionforrás paraméterekkel követtük nyomon: IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, függönygáz = 25. Az ionforrást a következő paraméterekkel követtük nyomon. A tömegspektrométert információfüggő akvizíció (IDA) top10 üzemmódban és nagy érzékenységű üzemmódban működtettük, 500 és 200 ms felhalmozási idővel az MS1 és MS2 szkennelésekhez, illetve 12 s dinamikus kizárással, ami ~2,55 s teljes munkaciklust eredményezett. A tömegspektrométeres elemzést TOF-MS1 és MS2 felmérési szkennelésekkel végeztük 350-1250, illetve 140-1600 m/z között. A gördülő ütközési energiát automatikusan az IDA gördülő ütközési energia paraméterszkript vezérelte. A fragmentálandó szülőion kiválasztási kritériumai közé tartozott az intenzitás – ahol az ionoknak nagyobbnak kellett lenniük, mint 150 cps, 50 mDa tömegtűrés, +2 és +5 közötti töltésállapottal. A spektrumok automatikus kalibrálása minden 2 minta felvétele után történt dinamikus LC-MS és MS/MS felvételei alapján 25fmol β-galaktozidázzal.

Adatfeldolgozás és elemzés

Az Akt1 és a vele kölcsönhatásban lévő fehérje partnerek MS-MS felvétele 3 különböző sejtciklus fázisban, azaz G0, G1/S és G2 fázisban történt. Az egyes fázisokat képviselő SILAC-címkézett sejteket három külön készletben egyesítettük és biológiai replikátumként szondáztuk. Minden egyes biológiai replikátum felvétele 2 wiff és 2 wiff.scan fájlt eredményezett, amelyek a technikai replikátumokat képviselik. A wiff-fájlokat ismét összevontuk minden egyes biológiai ismétléshez, mielőtt az UniProtKB/SwissProt Human adatbázisban (2015. áprilisi kiadás) a protein pilot szoftver 4.5. verziójával (1656-os revíziószám) elvégeztük a keresést. A referencia adatbázis 20 204 fehérje bejegyzést tartalmazott a megadott kiadásban. A protein pilot keresés a paragon algoritmuson alapult, amely a szoftver alapértelmezett statisztikájának része. A paragon-kereséshez a következő beállításokat használtuk: (a) faj: Homo sapiens, (b) Lys C és tripszin mint enzimkategóriák a különböző futtatásokhoz, (c) maximális kihagyott hasítások = 2, (d) rögzített módosítások mint SILAC-címkék: K6R6 és K8R10; cisztein-alkilezés metil-metán-tioszulfonáttal (MMTS), e) változó módosítások, mint oxidáció metioninnál, ami alapértelmezett opció a protein pilotban, f) azonosítás, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) és SILAC (Lys + 8, Arg + 10) mint mintatípusok, és g) “Search Effort” paraméter “Thorough ID”, ami a különböző fehérjemódosítások széles körű keresését teszi lehetővé, h) a prekurzor és fragment ionok tömegtűrése 0 volt.05 és 0,1 Da volt. Minden egyes biológiai ismétléshez SILAC-címkénként Lys C és tripszin emésztésű fájlokat generáltunk. Az adatok szűrésére a következő paramétereket alkalmaztuk annak érdekében, hogy a későbbi elemzéshez megbízható adatsort kapjunk: (a) Automatikus torzításkorrekciós algoritmust alkalmaztunk a nehéz és könnyű arányra. Ez korrigálja az egyenlőtlen keveredést a különböző címkézett minták kombinációja során egy kísérletben, és eltávolít minden kísérleti vagy szisztematikus torzítást. Az automatikus torzítási tényező a kezdeti fehérjemennyiségek eltéréseinek normalizálásával növeli a mennyiségi meghatározás pontosságát45, (b) Az 1%-os globális hamis felfedezési arányú (FDR) fehérjéket az illesztésből (G-FDR-fit) megtartottuk. Az FDR-elemzést a Protein Pilot szoftverrel telepített Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP) segítségével végeztük; c) A minimális fehérje megbízhatósági küszöbértéket 95%-ra állítottuk be; d) Legalább egy egyedi peptid azonosítása 95%-os megbízhatósággal mindhárom ismétlésben.

A Lys C és tripszin emésztés után nyert fehérjék listáit biológiai ismétlésenként összevontuk. A közepes és nehéz SILAC-jelölt fehérjék kvantitációs arányait a könnyebb fehérjékhez viszonyítva átlagoltuk. Ezt követően SILAC-jelölésenként három fehérjelistát kaptunk: K0R0, K6R6 és K8R10. Ezt követte az azonosított fehérjék egyesített listájának elkészítése; a kvantitatív becslést kézzel, az egyes SILAC-állapotok három biológiai ismétlésből származó fájlok egyesítésével végeztük. Azokat a fehérjéket, amelyeket mindhárom replikátumkészletben azonosítottak, megtartottuk a későbbi elemzéshez, és átlagoltuk a közepes és nehéz jelölések kvantitatív arányát a könnyű jelölésekhez képest ezekre a fehérjékre vonatkozóan. Ezután a K0R0 (G0 fázis), K6R6 (G2 fázis) és K8R10 (G1/S fázis) esetében egy végső kombinált fájlt készítettünk. Egy fehérje csak akkor került fel a végleges Akt1 interaktorok listájára, ha a sejtciklus bármelyik fázisában mindhárom replikátumkészletben azonosították. Az azonosított, de nem mindhárom ismétlésben számszerűsített fehérjékhez a peptid SILAC arányokba való behatolás után 0,01 (minimális) vagy 100 (maximális) számszerűsítési értéket rendeltünk.

Az Akt1 interaktorok listájának további tisztításához az affinitásmátrixszal vagy önmagában a címkével való nem specifikus kölcsönhatásoktól, SH címkézett GFP-t túlexprimáltunk HEK293 sejtekben. A GFP fehérje interakciós partnereit szelektíven eluáltuk az Akt1 fehérjekomplexeknél leírtak szerint. Az Akt1 sejtciklusfázis-specifikus interakciókkal átfedő fehérjéket eltávolítottuk az Akt1 interaktorok listájáról, mint nem specifikus fehérjéket. Így végül egy biztos adathalmazt kaptunk az Akt1 interakciós partnereihez. Az Akt1 interakcióban lévő fehérjékre vonatkozó információk és kvantitási becsléseik összefoglalása a 3. kiegészítő táblázatban található. Ezeket elosztva az Akt1 arányával a megfelelő fázisban normalizált kvantitatív arányokat az összes Akt1 interaktorra vonatkozóan. Ezáltal az Akt1 1-nek adta az egységességet a G0, G1/S és G2 fázisokban.

Poliakrilamid gélelektroforézis és Western blotting

Az azonosított Akt1 interaktorok listájából véletlenszerűen kiválasztottuk a CDK1, CCNB1, BUB3, API5 és SH3PX1 fehérjéket, hogy Western blottinggal validáljuk az Akt1-hez való társulásukat. Az aszinkronizált Akt1-et expresszáló sejtpelletet IP-pufferben lizáltuk, és a korábban leírtak szerint SH-tagot célzó affinitás-tisztításnak vetettük alá. Az eluátumokat összevontuk és 1X SDS mintapufferben hígítottuk, majd 10 percig melegítettük, és 10%-os SDS-PAGE-n oldottuk fel. A fehérje sávokat nitrocellulóz membránra vittük át, és az utóbbit 1:1 odyssey blokkoló pufferrel blokkoltuk: PBS-szel egy órán át szobahőmérsékleten. Ezután a membránt felvágtuk, hogy a különböző méretű fehérjéket a megfelelő primer antitestekkel szondázhassuk a validáláshoz az anti-HA antitesttel együtt. Az elsődleges antitest hígítását odyssey pufferben végeztük: PBST-ben, és egy éjszakán át 4 °C-on rázógépen inkubáltuk. Alapos mosás után a blotokat a megfelelő IR-jelölt anti egér vagy anti nyúl másodlagos antitestekkel 1:15000 hígításban, odyssey pufferben hígítva exponáltuk: PBST. A sávokat odyssey infravörös szkennerrel detektáltuk.

A fordított koimmunoprecipitációt is elvégeztük Dynabeads protein A segítségével. A korábban detektált Akt1 interaktorokat csalifehérjékként használtuk, és az Akt1-et mint interakciós partnerüket anti-Akt1 antitesttel szondáztuk. A kiválasztott Akt1 interaktorok elleni antitesteket külön csövekben 50 µl dynabeadshoz kevertük 1:20-1:70 koncentrációban; 200 µl PBST-ben hígítva. A gyöngy-antitest keverékeket szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. A gyöngy-antitest komplexeket mágneses szeparátorral pelletáltuk és 200 µl PBST-ben mosáshoz újra szuszpendáltuk. Ezt követően 250 µl lizátumot adtunk minden egyes csőbe, és 4 °C-on 2 órán át inkubáltuk rotációs rázógépen. A gyöngyöket a megfelelő antitest-antigén komplexekkel együtt ismét pelletáltuk és mosásonként háromszor 200 µl PBST-vel mostuk. Ezután a gyöngyöket 50 µl 1X SDS mintapufferben 10 percig forraljuk, majd lehűtjük. A felülúszót 10%-os SDS-PAGE-ra töltöttük, és western blottinggal szondáztuk. Anti-Akt1 antitestet használtunk az Akt1 szondázására az API5, CCNB1, CDK1, BUB3 és SH3PX1 elúciójában.

GO osztályozás

Az egyes Akt1 interaktorok funkcióját ábrázolóGO osztályokat az UniProt (http://www.uniprot.org/) és EnrichR adatbázisokból (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/) határoztuk meg. Kiterjedt kézi kuráció után az azonosított Akt1 interaktorokat 3 fő funkcionális osztályba soroltuk: proliferáció és túlélés; metabolizmus; és fehérjeszintézis. A többit egy “egyéb” nevű közös osztályként ábrázoltuk, amely olyan funkciókkal rendelkező fehérjéket tartalmazott, mint a szállítás, hematopoézis stb.

Gene Knockdown siRNS használatával

Standardizáció

A siRNS optimális koncentrációjának meghatározásához a transzfekcióhoz 1,2 × 105 HEK293 sejtet vetettünk 12 lyukú lemezbe. a PLK1 elleni siRNS-t pozitív kontrollként használtuk minden knockdown vizsgálatban. A siRNS-koncentrációk 10 nM és 50 nM közötti tartományát transzfektáltuk a dharmafect transzfekciós reagenssel, a szállítói protokoll szerint. A fehérjeexpressziós szintek változásait western blottinggal követtük nyomon 24, 48, illetve 72 órán belül (2. kiegészítő ábra). Néhány további célpontot (SH3PX1, AKT1, CCNB1 és SLC25A5) leütöttünk, és a leütés hatását western blottinggal határoztuk meg. A GAPDH-t terheléskontrollként használtuk.

A célfehérjék kopogtatása

A HEK293 sejtekben egyenként kopogtattuk le azokat a fehérjéket, amelyek az Akt1-gyel való zavaros társulást mutatták, miközben a sejt a sejtciklus G0-ból a G1/S fázisba haladt, és FACS segítségével vizsgáltuk. Minden siRNS-t 1x siRNS pufferben szuszpendáltunk újra, hogy 20 µM-os alapkoncentrációt kapjunk. A transzfekciót a sejtek kiültetése után 24 órával három példányban végeztük; a megfelelő pozitív és negatív kontrollokkal együtt. Minden siRNS-t 25 nM munkakoncentrációra hígítottunk RPMI-ben, hogy a végső térfogat 50 µl legyen, és 5 percig szobahőmérsékleten tartottuk az inkubációt. Hasonlóképpen a transzfekciós reagenseket is RPMI-ben hígítottuk 50 µl térfogatra, és hasonló körülmények között inkubáltuk. Mind az siRNS-t, mind a transzfekciós reagenseket óvatosan összekevertük, hogy komplexeket képezzenek, és további 20 percig folytattuk az inkubációt szobahőmérsékleten. A végső térfogatot 10% szérumot tartalmazó médiummal 500 µl-re állítottuk be. Ezeket a komplexeket ezután óvatosan hozzáadtuk a sejtekhez, és 37 °C-on folytattuk az inkubációt. A sejttenyésztő táptalajt 24 óra elteltével friss 10%-os táptalajjal helyettesítettük. Végül 48 órával a transzfekció után a transzfekció hatékonyságát a siGLO Nikon Ti invertált mikroszkóp alatt történő megfigyelésével határoztuk meg.

FACS felvétel és elemzés

A transzfekciót követő 48 órában a sejteket röviden centrifugáltuk és a médiumot leszívtuk. A sejteket 300 µl propidium-jodid oldattal festettük, amely 0,1 mg/ml propidium-jodidot (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100-at (Sigma), 1 mg/ml nátrium-citrátot (Sigma) és 20 µg/ml RNázt (Sigma) tartalmazott, 30 percig 4 °C-on. A festett sejteket azonnal átvittük BD FACS csövekbe, és a BD FACS Canto-ban rögzítettük.

A kapott adatokat FlowJo szoftverrel elemeztük. A DNS-hisztogramokat elemeztük a G0, G0/G1, S és G2/M alpopulációk mennyiségi meghatározásához. A G0/G1 és G2/M populációkban kisebb eltolódásokat figyeltünk meg, ezért manuális gatinget végeztünk ezen populációk elemzéséhez.

PDT és RT számítás

A sejtciklus G1, S és G2 fázisaiban a sejtciklus azon fehérjék siRNS knockdownját követően számítottuk ki, amelyek a G1/S fázisban az Akt1-gyel való perturbált társulást mutatták. A 23 gén PDT-jét a kontrollokkal együtt 72 órán keresztül követtük nyomon HEK293 sejtekben. Röviden, 10 000 sejtet vetettünk 96 lyukú lemezbe, 100 µl RPMI médiumba, 10% szérummal. siRNS transzfekciót közvetítettünk a következő napon minden célfehérje esetében három példányban, és 0 órás időpontnak tekintettük. A sejtek számát a kezeletlen HEK293 sejtek esetében trypan-kék festési módszerrel határoztuk meg. 24 óra elteltével az siRNS-komplexeket tartalmazó sejttenyésztő médiumot 10% szérumot tartalmazó friss RPMI-re cseréltük. Ezt követően minden egyes siRNS-transzfektált sejt esetében megszámoltuk a sejteket, hogy a 24 órás időpontot reprezentáljuk. Ezt követően a párhuzamos tenyészetben futó sejtek egy csoportját 48 órás, illetve 72 órás időpontokban szedtük le és számoltuk meg.

Mihelyt a PDT-t meghatároztuk a perturbált gének összes célzott készletére vonatkozóan, a G1, S és G2 fázisra vonatkozó RT-t (órában) az alábbiak szerint számoltuk ki:

where; A sejtek %-os populációját FACS felvétellel határoztuk meg.

Adatok elérhetősége

A tömegspektrometria adatait “Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” adatkészletként a PRIDE adatbázison keresztül letétbe helyeztük a ProteomeXchange-be. Az adat nyilvánosan elérhető a ProteomeXchange-en keresztül a ProteomeXchange azonosítóval: PXD005557 AZONOSÍTÓVAL. Az adatkészlet 12 nyers fájlból (wiff és wiff.scan) és kapcsolódó 18 fehérje pilot fájlból áll.