ABSTRACT

A ligációt megelőzően az eukariótákban a lemaradó szálon szintetizált Okazaki-fragmentumokat nukleolitikusan kell feldolgozni. A nukleáz hasítás a DNS-polimeráz delta által végzett száleltolódásos szintézis révén létrehozott 5′-os lebenyszerkezetek kontextusában történik. Legalább három DNS-nukleáz: A Rad27 (Fen1), a Dna2 és az Exo1 szerepet játszanak az Okazaki-fragmensek feldolgozásában. Azonban sem az egyes nukleázok hozzájárulását a késleltetett szálak szintéziséhez, sem a távollétükben képződő DNS-intermedierek szerkezetét nem határozták meg egyértelműen in vivo. A lagging-strand nukleázok feltételes depletálásával és az in vivo S. cerevisiae-ben szintetizált Okazaki fragmentumok közvetlen elemzésével szisztematikusan értékeljük a Rad27, a Dna2 és az Exo1 lagging-strand szintézisre gyakorolt hatását. Azt találtuk, hogy a Rad27 dolgozza fel a lagging-szálak zömét, amihez az Exo1 jelentős mértékben járul hozzá, de a Dna2 nem. Ha a nukleáz hasítás károsodik, a szál-eltolódás szintézisének csökkenését tapasztaljuk, szemben a hosszú Okazaki fragmentum 5′-os lebenyek széleskörű keletkezésével, ahogyan azt egyes modellek előre jelzik. Továbbá, sejtciklus-korlátozott konstrukciókat használva bizonyítottuk, hogy mind a nukleolitikus feldolgozás, mind az Okazaki-fragmentumok ligációja függetleníthető a DNS-replikációtól, és késleltethető mindaddig, amíg a genom többségének szintézise be nem fejeződik.