Často kladené otázky (FAQ) o lentivirálních plazmidech

Jaký je rozdíl mezi lentivirálními systémy 2. a 3. generace?

Úplný popis lentivirů 2. a 3. generace naleznete výše v části 2. vs. 3. generace. Stručně řečeno, lentivirové systémy 2. generace používají více proteinů HIV (na menším počtu plazmidů), aby vytvořily funkční lentivirové částice, než systémy 3. generace.

• Pakovací systémy 2. generace: exprimují geny HIV gag, pol, rev a tat z jednoho obalového plazmidu, jako je psPAX2.
• Pakovací systémy 3. generace: exprimují gag a pol z jednoho obalového plazmidu a rev z jiného, jako jsou pMDLg/pRRE a pRSV-Rev. Balicí systémy 3. generace NEexprimují tat. Lentivirové systémy třetí generace jsou považovány za bezpečnější než systémy druhé generace, ale jejich použití může být obtížnější, protože k vytvoření funkčních lentivirových částic vyžadují transfekci čtyřmi samostatnými plazmidy.

DŮLEŽITÉ : Přenosový plazmid třetí generace lze použít s obalovým systémem druhé generace, ale přenosový plazmid druhé generace nelze použít s obalovým systémem třetí generace.

Jaký je rozdíl mezi lenvirem a retrovirem?

Lentiviry jsou podtypem retroviru. Z experimentálního hlediska je hlavní rozdíl mezi lentiviry a standardními retroviry (γ-retroviry) v tom, že lentiviry jsou schopny infikovat nedělící se a aktivně se dělící typy buněk, zatímco standardní retroviry mohou infikovat pouze mitoticky aktivní typy buněk. To znamená, že lentiviry mohou infikovat větší množství buněčných typů než retroviry.

Jak lentiviry, tak standardní retroviry používají k balení gag, pol a env geny; jedná se však o různé viry, a proto používají mírně odlišné izoformy těchto obalových složek. Proto nemusí být lentivirus účinně balen retrovirovými balicími systémy a naopak.

Který bakteriální kmen by měl být použit pro klonování a výrobu mých lentivirových plazmidů?

Vzhledem k dlouhým terminálním repeticím, které se vyskytují v lentivirových plazmidech, doporučujeme použít kmen, který snižuje frekvenci homologní rekombinace nestabilních oblastí, například Invitrogen Stbl3™ nebo NEB Stable cells. To zajistí zachování repetic a často vede k větší výtěžnosti DNA. Pokud však plazmid obsahuje Gateway kazetu obsahující gen ccdB, je nutný kmen pro přežití ccdB.

Jakou buněčnou linii je třeba použít k výrobě lentiviru?

K výrobě lentiviru se obvykle používají buňky 293T. Buněčnou linii 293T lze získat od společnosti GenHunter.

Co určuje dosah lentivirové hostitelské buňky (tropismus)?

Tropismus lentivirových virů je určen schopností obalového proteinu viru interagovat s receptory na povrchu hostitelské buňky. Obalový protein VSV-G se běžně používá při výrobě lentivirových částic, protože propůjčuje široký tropismus v celé řadě druhů a typů buněk. Další informace naleznete v článku Cronin, et al. o různých obálkových proteinech a jejich tropismu.

Jak lze lentivirus použít k vytvoření stabilních buněčných linií?

Lentiviry lze použít k vytvoření stabilních buněčných linií stejným způsobem jako standardní retroviry. To znamená, že mnoho genomů lentivirů má selektovatelné markery, jako je gen rezistence vůči puromycinu, které propůjčují infikovaným hostitelským buňkám rezistenci vůči antibiotikům. Když se tato antibiotika přidají do růstového média hostitelských buněk, zahubí všechny buňky, které neinkorporovaly genom lentivirového viru, a ty buňky, které přežijí, mohou být rozšířeny a vytvořit stabilní buněčné linie, které inkorporovaly genom lentivirového viru a nesou genetickou informaci zakódovanou tímto genomem.

Mnoho lentivirových přenosových plazmidů nemá selekční markery propůjčující odolnost vůči antibiotiku, ale kóduje jiný marker, například GFP. Výzkumník může použít FACS ke třídění buněk exprimujících GFP a později tyto buňky rozšířit do buněčné linie.

Kde se lentivirus integruje?

Celogenomové studie virové integrace ukázaly, že lentiviry se nejčastěji integrují do aktivně přepisovaných genů a že tato preference je zachována napříč cílovými druhy. Ačkoli dostupnost chromatinu usnadňuje integraci, nevysvětluje preferenci lentivirových genů pro transkribované geny. Studie srovnávající lentivirus HIV a retrovirus MMLV naznačují, že virová integráza hraje roli při utváření preferencí míst integrace. Hlavním buněčným determinantem je LEDGF/p75, lentivirový tetheringový protein, který rekrutuje preintegrační komplex k transkripčním jednotkám a usnadňuje integraci. Vazebná místa LEDGF/p75 jsou obohacena v tělech genů a většinou chybí v promotorech a intergenních oblastech, což odráží vzorce lentivirové integrace.

Mohou být lentivirální plazmidy použity při přímých transfekcích na rozdíl od výroby viru?

Některé (ale ne všechny) lentivirální přenosové plazmidy mohou být použity při přechodných transfekcích k dosažení exprese transgenu a ty, které mohou, jsou především konstrukty třetí generace. Lentivirální přenosové plazmidy nejsou navrženy speciálně pro transientní transfekce. Proto může dojít k omezené expresi transgenu v důsledku lentivirálních LTR. I když je to možné, výslovně se nedoporučuje používat lentivirální přenosové plazmidy pro jednoduché transfekce.

Je možné exprimovat cDNA z lentivirových přenosových plazmidů běžně používaných pro expresi shRNA?

Ano, je to možné, ale nejprve je třeba upravit promotor v přenosovém plazmidu. Většina lentivirových plazmidů pro expresi shRNA, jako je pLKO.1, používá promotor U6 nebo H1, aby řídil transkripci shRNA řízenou RNA pol III. exprese cDNA vyžaduje RNA pol II, a proto vyžaduje promotor RNA pol II, jako je CMV nebo RSV.

Jaké techniky lze použít ke klonování inzertu do lentivirového plazmidu obsahujícího pouze jedno restrikční místo?

Pokud lentivirový přenosový plazmid obsahuje jediné restrikční místo, lze k ligování inzertu do tohoto místa použít standardní techniky klonování. Pokud není možné okamžitě strávit a naklonovat insert z mateřského vektoru, některé možné přístupy k použití tohoto místa zahrnují subklonování nebo přidání kompatibilních restrikčních míst na zájmový insert pomocí PCR. Proces subklonování spočívá v natrávení zájmového inzertu z mateřského vektoru a jeho podvázání do druhého vektoru tak, aby mohl být později z tohoto nového vektoru natráven a naklonován do lentivirového vektoru. Jedná se v podstatě o přehazování restrikčních míst mezi vektory, dokud není zájmový gen obklopen místy kompatibilními s místy ve vektoru, do kterého chceme vložený gen nakonec podvázat. Často je méně časově náročné a jednodušší jednoduše přidat restrikční místa na zájmový insert pomocí PCR. Toho se dosáhne PCR amplifikací sekvence inzertu pomocí primerů, které obsahují potřebná restrikční místa. Funkční restrikční místa musí být vzdálena určitý počet bází od konců použitých primerů. Alternativně můžete do jediného místa v lentivirovém vektoru ligátovat vícenásobné klonovací místo (MCS) ze samostatného vektoru a vytvořit více užitečných restrikčních míst.

Další informace o klonování a změně MCS naleznete v příručce Addgene Plasmid Reference and Protocol Guide.

Jak naklonovat svůj insert do přenosového vektoru bez použitelných restrikčních míst, ale kompatibilního s klonovacím systémem Gateway®?

Vektory kompatibilní s Gateway® používají rekombinaci za účelem generování klonů obsahujících zájmový insert. Stručně řečeno, insert se nejprve naklonuje do vstupního vektoru v oblasti lemované sekvencemi (nazývanými attP1 a attP2), které umožňují rekombinaci insertu s cílovým vektorem (v tomto případě by cílovým vektorem byl lentivirový přenosový vektor). Cílový vektor obsahuje sekvence attB, s nimiž sekvence attP rekombinují. Další informace o klonovacím systému Gateway® naleznete na webových stránkách společnosti Invitrogen.

Jaké bezpečnostní obavy provázejí použití lentivirových vektorů?

Jak uvádí NIH, dvě hlavní bezpečnostní obavy spojené s použitím lentivirových vektorů jsou následující:

1. Potenciál vzniku replikačně kompetentního lentiviru
2. Potenciál onkogeneze

Potenciál vzniku replikačně kompetentního lentiviru je řešen konstrukcí vektorů a bezpečnou laboratorní praxí. Pokud jde o návrh vektorů, lentivirální systémy 2. a 3. generace poskytované společností Addgene oddělují přenosové, obalové a obalové složky viru na různých vektorech. Přenosový vektor kóduje zájmový gen a obsahuje sekvence, které se začlení do genomu hostitelské buňky, ale nemůže vytvořit funkční virové částice bez genů kódovaných v obálkovém a obalovém vektoru. Pokud nedojde k rekombinaci mezi obalovým, obalovým a přenosovým vektorem a výsledný konstrukt není zabalen do virové částice, není možné, aby se viry běžně produkované z těchto systémů po počáteční infekci replikovaly a produkovaly další virus. V tomto ohledu jsou systémy 3. generace považovány za bezpečnější než systémy 2. generace, protože obalový vektor byl rozdělen na dva samostatné plazmidy (výsledkem je celkem čtyřplazmidový systém). Kromě toho systémy 3. generace nepoužívají protein HIV tat k produkci viru plné délky z přenosového vektoru ve fázi produkce viru.

Mnoho lentivirálních přenosových vektorů, které byly uloženy u společnosti Addgene, jsou samoinaktivační (SIN) vektory. Tyto vektory mají deleci v 3’LTR virového genomu, která se po jednom kole reverzní transkripce přenese do 5’LTR. Tato delece zruší transkripci viru plné délky poté, co se inkorporuje do hostitelské buňky.

Potenciál onkogeneze je do značné míry založen na konkrétním inzertu obsaženém v lentivirálním přenosovém vektoru (v závislosti na tom, zda se jedná o onkogen či nikoli) a měl by být zvažován případ od případu.

Vždy je třeba zvážit biologickou bezpečnost s ohledem na přesnou povahu prováděných experimentů a vaše kancelář pro biologickou bezpečnost vám může poskytnout více informací o osvědčených postupech vaší instituce s ohledem na lentivirový výzkum. NIH má k dispozici další informace o bezpečnostních aspektech lentivirů.