”En molekylärgenetisk teknik som används för att direkt manipulera, förändra eller modifiera gener eller organismers arvsmassa för att manipulera fenotyperna kallas genteknik.”

Och med andra ord kan vi säga:

”Genteknik är en teknik med hjälp av vilken den genetiska sammansättningen hos en organism kan ändras”.

Tekniken kallas ofta för genetisk manipulation, genetisk modifiering eller genetiska förändringar, i stort sett kategoriseras den som genteknik.

I denna teknik konstrueras ett rekombinant DNA och infogas i värdgenomet med hjälp av en vektor. Eller så raderar man några muterade sekvenser från ett genom. Det första rekombinanta DNA:t konstruerades av Paul Berg 1972.

Med hjälp av gentekniken kan man konstruera genetiskt modifierade organismer som är ekonomiskt mycket viktiga för oss.

Det används för produktion av förbättrade växtarter, terapeutiska läkemedel eller proteiner, förebyggande av ärftliga genetiska störningar och konstruktion av en genetiskt modifierad organism.

I den här artikeln kommer vi vårt huvudföredrag att vara genteknik och dess tillämpningar. Innehållet i artikeln är,

• Vad är genteknik
  • Definition
  • Historia
  • Typer
  • Process

.

• Användning av genteknik
• Begränsningar av genteknik
• Slutsats

Människor har länge manipulerat det genetiska materialet hos många organismer. Med hjälp av selektiv avel och korshybridisering har ekonomiskt viktiga växtarter skapats av oss.

Syftet med att utveckla gentekniken eller tekniken för genmanipulering är att producera organismer eller fenotyper som är användbara för oss. Gentekniken används för,

• Byggandet av genetiskt modifierade växtarter.
• Abiotiska och biotiska stressresistenta växtarter.
• Ekonomiskt viktiga växtarter
• Kommersiellt värdefull organism
• För produktion av terapeutiska läkemedel
• Förebyggande av genetiska abnormiteter.

”Vid genteknik kombineras två olika cellers DNA och förs in i värdgenomet via en vektor.” Viktiga komponenter i experimenten med genmanipulation förklaras här.

Gen av intresse: En DNA-sekvens som vi vill infoga i våra målceller.

Vektor: Med hjälp av plasmid-DNA-liknande vektorer förs genen av intresse in i värdgenomet. Vektorer är ett slags fordon som överför det genetiska materialet.

Målceller: Målceller är den population av celler vars genom vi vill manipulera eller förändra.

Definitioner:

”En teknik som används för att infoga eller ta bort en muterad gen eller för att manipulera en organisms arvsmassa kallas genteknik.”

Genteknikens historia:

Tecknet genteknik användes först av en science fiction-romanförfattare, inte av någon vetenskapsman. År 1951 använde Jack Williamson termen ”genteknik” för första gången i sin roman ”Dragon’s island”.

Snart därefter upptäcktes DNA:s molekylära struktur av Watson och Crick, även om genetiska experiment var populära sedan Mendels tid.

Det första rekombinanta DNA:t konstruerades av Paul Berg 1972. Samma år utförde Herbert Boyer och Stanley Cohen experiment med genöverföring. År 1974 hade Rudolf Jaenisch skapat genetiskt modifierade möss, för första gången i genetikens historia.

Efter Rudolfs framgång utvecklades 1976 den genetiskt modifierade eller genmanipulerade tobaksplantarten.

Under denna period (mellan 1960 och 1990) upptäcktes restriktionssprängning, ligering och PCR-liknande tekniker som gav vingar åt gentekniktekniken.

Relaterad artikel: Vad är ett genom?

Typ av genteknik:

Recombinant DNA- Rekombinant DNA-teknik är en typ av genteknik där en konstgjord DNA-molekyl konstrueras genom att två olika DNA:er ligeras med hjälp av fysiska metoder. För detta sätts genen av intresse in i plasmidvektorn och används för genöverföringsförsök.

Genleverans- Genleveransteknik används för att föra in en intressant gen i värdgenomet.

Elektroforering, solicitation och virusvektormedierad genöverföring, liposommedierad genöverföring, transposonmedierad genöverföring är några av de metoder som används för detta.

Genredigering- En genredigeringsteknik används för att redigera genomet där en oönskad DNA-sekvens tas bort eller en ny gen kan införas i värdgenomet. CRISPR-CAS9, TALEN och ZFN är några kända genredigeringsverktyg som används i genterapiexperiment.

Läs mer: Vad är genredigering och CRISPR-CAS9?

Process för genteknik:

Den gentekniska tekniken används för många olika ändamål och därför måste vi först bestämma syftet med experimentet. Hela den gentekniska processen kan delas in i fem bredare steg:

• Väljning och isolering av kandidatgen
• Väljning och konstruktion av plasmid
• Genomvandling
• Insättning av DNA i värdgenomet
• Bekräftelse av insättning

Väljning och isolering av kandidatgen:

Genen måste innehålla en DNA-sekvens som vi vill studera och för det har en gen vissa speciella egenskaper. En kandidatgen bör ha ett högt GC-innehåll och en lägre repetitiv DNA-sekvens.

Den intressanta genen får dessutom inte vara för lång – endast några kb gener kan framgångsrikt införas. Längre gener ökar risken för misslyckande. Kandidatgenen måste ha en start- och stoppkodon i den. Relaterad artikel: Nu kan den intressanta genen isoleras från resten av DNA:t med hjälp av antingen restriktionsspjälkning eller polymeraskedjereaktion.

Restriktionsendonukleaserna är det bakteriella enzym som har förmågan att smälta DNA-sekvensen på en specifik plats. Med hjälp av en specifik typ av restriktionsendonukleas kan vi klippa och isolera vår gen av intresse.

Metoden för restriktionsspjälkning förklaras i vår tidigare artikel: Vad är restriktionssprängning?

I polymeraskedjereaktionen amplifieras den intressanta genen eller kandidatgenen i termocyklern med hjälp av informationen om gensekvensen.

Maskinen gör med hjälp av polymeraskedjereaktionen miljontals kopior av en gen av vårt intresse. Genom agarosgelelektrofores isoleras den amplifierade genen.

Om genen av intresse är välstuderad, tidigare, är informationen om en gen tillgänglig i det genetiska biblioteket och vi kan använda den för artificiell syntes av en gen av vårt intresse. (Med hjälp av informationen i det genetiska biblioteket kan genen också syntetiseras artificiellt)

I nästa steg utför du vid behov DNA-rensning. Nu är vårt DNA redo att infogas i en plasmid.

Urval och konstruktion av plasmid:

Väljandet av plasmid för det gentekniska experimentet är ett av de avgörande stegen i hela experimentet. Innan vi väljer plasmid måste vi förstå varför plasmidet används i genöverföringsförsöken.

Plasmid-DNA är ett cirkulärt, dubbelsträngat cytoplasma-DNA från bakterierna som replikerar oberoende av varandra.

Vetenskapsmännen använder det som ett medel för att överföra den intressanta genen till målplatsen i genomet. Den kan effektivt överföra genen till målplatsen. Plasmidens struktur förklaras i figuren nedan,

Relaterad artikel: Vad är en plasmid?

Preparering av plasmid:

Välj den plasmid som passar ditt experiment.

Plasmiden måste ha replikationsursprunget, promotorregionen, antibiotikaresistensgenen och andra viktiga sekvenser. Med hjälp av restriktionssmältningsmetoden införs en insättningsplats i plasmidet där vår gen av intresse ligeras.

Med hjälp av T4-dna-ligaset, som en kraftförseglare, sätts DNA:t av vårt intresse in och ligeras i plasmidet. Tillsammans med plasmidet införs också en selekterbar markör i plasmid-DNA:t för att identifiera det rekombinanta DNA:t.

Därutöver inkluderas också en promotorregion och terminatorsekvenser i plasmidet för effektivt uttryck av en gen av vårt intresse. En plasmid med vår gen av intresse och några andra viktiga sekvenser kallas nu för en rekombinant DNA-molekyl.

Nu är vårt rekombinanta DNA redo för för för uttrycket.

Om vi utför genkloning sätts plasmiden in i en bakteriell värd, för detta används vanligen E.Coli. När bakterien börjar dela sig replikeras även vårt rekombinanta plasmid-DNA tillsammans med den.

Nu har vi flera kopior av vårt plasmid-DNA som extraheras med hjälp av plasmid-DNA-extraktionskitet och används för transformationsförsöken.

Transformation till värdgenomet:

Transport av det rekombinanta DNA:t till den mottagande cellen eller värdgenomet är ännu en tråkig och svår uppgift. Olika metoder för insättning av rekombinant DNA används för olika celltyper eftersom en enda metod inte kan användas för alla celltyper.

Olika metoder för transformation:

Användning av stress – bakterier tar lätt upp plasmid-DNA med hjälp av vissa stressfaktorer som värme eller elektrisk strumpa.

Mikroinjektion- en vass nål används för att föra in DNA direkt i cellkärnan, men metoden är mindre effektiv och kräver en högre nivå av expertis för det.

Elektroporation- en av de bästa metoderna som har stor framgång är elektroforeringsmetoden där det rekombinanta DNA:t förs in i värdgenomet genom att permeabilisera cellen med elektrisk ström.

Vi har behandlat en hel artikel om detta. Läs den här: Electroporation- A Modern Gene Transfer Technique.

Sonikation- Sonikation är ännu en bra metod som ibland används i genöverföringsexperimentet där det rekombinanta DNA:t förs in i målcellen med hjälp av ultraljudsvågor. Ultraljudsvågorna ökar också cellernas genomsläpplighet.

Liposommedierad genöverföring- Med hjälp av en konstgjord cellliknande yttre hölje, en så kallad liposom, kan rekombinant DNA föras in i värdgenomet.

Genöverföring med hjälp av bakterieinfektion- Denna metod är en av de populära metoderna och används rutinmässigt i växtgenetiska experiment. Här infekteras växtarten med de transformerade bakterierna för att infoga en gen av intresse.

Agrobacterium tumifecian används för att infoga rekombinant DNA i växtcellen. En gen av intresse sätts in i Agrobacteriums Ti-plasmid. Växtcellerna infekteras av denna bakteriecellkultur och de transformerade cellerna regenereras med hjälp av växtvävnadskulturmetoder.

Kemisk i genöverföring- Vissa metalljoner, kemikalier och lösningar av olika kemikalier används också i genöverföringsförsöken, men framgångsfrekvensen är för låg jämfört med de andra metoderna.

Bekräftelse av insättning:

Vårt arbete är fortfarande inte avslutat.

Nu måste vi bekräfta, om det rekombinanta DNA:t är infört i vår målcell eller inte. Olika molekylärgenetiska tekniker används för detta. I den traditionella odlingsmetoden används närvaron eller frånvaron av en selekterbar markör för att skilja transformerade celler från otransformerade celler.

Det är dock inte nödvändigt för den PCR-baserade detektionsmetoden. Den polymeraskedjereaktionsbaserade detektionsmetoden är allmänt accepterad mer pålitlig än andra metoder.

DNA extraheras från den transformerade cellen och amplifieras med hjälp av primers som är komplementära till vår gen av intresse eller vårt rekombinanta DNA.

Om det rekombinanta DNA:t finns närvarande amplifieras det säkert, annars erhålls ingen amplifiering. För tvåfaktorskonformationen används en primeruppsättning som är komplementär till det rekombinanta DNA-specifika och en primeruppsättning som är komplementär till den selekterbara markörsekvensen och multiplex-PCR utförs.

För att validera resultaten måste amplifiering erhållas i båda reaktionerna.

Men vänta lite!

Vad händer om någon mutation inträffar under experimentet i vår gen av intresse? Eftersom PCR endast kan amplifiera DNA. Vi måste behöva sekvensinformation för att upptäcka mutationen.

För detta används DNA-sekvenseringsmetoden.

DNA extraheras från de transformerade cellerna och genen av intresse amplifieras med hjälp av PCR. Nu används PCR-amplikonerna för DNA-sekvensering där man med hjälp av fluorescerande kemi bestämmer sekvensen för vår intressanta gen på ett ordnat sätt.

När alla parametrar för att bestämma den intressanta genen är uppfyllda är våra celler nu redo att injiceras i värdorganismen eller för vävnadskulturförsök.

Tillämpningar av genteknik:

Nu kommer vi till den viktiga punkten i detta ämne: ”Vad används genteknik till?”

Genteknik har ett stort industriellt och jordbruksmässigt värde. Den används inom medicin, genetisk forskning, jordbruk, förbättring av grödor och för produktion av terapeutiska läkemedel.

Det används också vid utveckling av genetiskt modifierade organismer. Här diskuterar vi några av de viktiga tillämpningarna av genteknik.

Den rekombinanta DNA-tekniken används för förbättring av grödor och utveckling av nya ekonomiskt viktiga egenskaper. Några av dem är:

• Herbicidresistens
• Virusresistens
• fördröjd fruktmognad
• förändrat oljeinnehåll
• Pollenkontroll
• Utveckling av kall- och torktoleranta växtarter.

Ett klassiskt exempel är BT-bomull – en av typerna av genetiskt modifierade arter ger växten resistens mot Bacillus thuringiensis.

Processen för att utveckla genetiskt modifierade växtarter:

En gen av intresse isoleras från organismen med hjälp av restriktionssmältning eller amplifieras genom polymeraskedjereaktion. Rekombinant DNA konstrueras genom att en gen av intresse infogas i plasmid, här används T-plasmid.

I nästa steg sätts T-plasmidan in i agrobacterium. I det sista steget infekteras växtarten med de transformerade bakteriecellerna och odlas. Hela processen visas i figuren nedan,

GMF- genetiskt modifierade livsmedel är en annan bästa tillämpning av genteknik där ekonomiskt viktiga livsmedelsprodukter konstrueras med hjälp av rekombinant DNA-teknik.

Det klassiska exemplet är Flavr Savr-tomaten, en genetiskt modifierad tomatart som består av antisense RNA-teknik. Den har stora ekonomiska värden eftersom den genetiskt modifierade tomaten lätt kan transporteras från en plats till en annan.

En annan viktig tillämpning av genteknik är genetiskt modifierade eller genmanipulerade livsmedel.

Kvaliteten på vissa livsmedelsprodukter som bomull, majs och sojabönor förbättras med hjälp av den nuvarande rekombinanta DNA-tekniken. Syftet med att utveckla genetiskt modifierade grödor eller växtarter är att göra dem ekonomiskt viktiga, näringsrika, proteinrika, sjukdoms- och stresståliga.

Med hjälp av genteknik och vävnadskulturteknik utvecklas insekticidresistenta växtarter i tobak, potatis, majs och bomull.

Den nuvarande genmodifieringstekniken kan dessutom användas för att skapa vissa modifierade växter som kan generera sina egna gödningsmedel.

Transgena modellorganismer utvecklas för att testa olika parametrar – funktionen hos vissa gener kan fastställas genom att utforma transgena mikroorganismer och djurmodeller.

Skadliga patogener och insektspastorier kan förstöras med hjälp av genetiskt modifierade mikroorganismer som kan bryta ner gifter.

Medicinska tillämpningar:

Lågprisläkemedel, hormoner, enzymer och vacciner skapas med hjälp av gentekniska verktyg.

Blodproppshämmande faktor är det bästa exemplet där det plasminogenaktiverande enzymet, som kan lösa upp blodproppen, utformas på konstgjord väg och används hos patienter med kranskärlssjukdom eller hjärtinfarkt.

Andra exempel är två andra terapeutiska proteiner somatostatin och lymfokiner som verkar mot flera sjukdomstillstånd och kan syntetiseras artificiellt. Insulin är ännu ett klassiskt exempel på ett terapeutiskt protein som utformats med hjälp av genteknik.

En gen för insulin isoleras genom restriktionssmältning eller genom PCR och infogas i plasmidet. Det rekombinanta plasmid-DNA:t sätts omedelbart in i den bakterie- eller jästcell i vilken plasmidet förökar sig. När mikroorganismen börjar dela sig börjar den producera artificiellt insulin.

En stor mängd insulin produceras med samma teknik i industriell skala. Den detaljerade skissen över insulinproduktionen visas i figuren nedan,

Den kommersiella produktionen av insulin startade efter FDA:s godkännande 1982.

Recombinanta vacciner:

Vacciner mot smittkoppor, herpes simplex-virus och hepatit framställs med hjälp av genteknik. Vaccinerna är inaktiverade viruspartiklar som används för att framkalla ett immunsvar mot den patogenen, men risken för kontaminering är stor i det.

Med hjälp av rekombinant DNA-teknik har forskare skapat en unik typ av vaccin som endast innehåller DNA:t för virusets pälsprotein, vilket innebär att patogenen aldrig kan aktiveras igen. Den största fördelen med detta är att det är säkrare, kontaminationsfritt och mer reaktivt.

Genetisk ingenjörskonst inom genterapi:

Med hjälp av genterapi eller genöverföringsteknik kan ärftliga genetiska sjukdomar botas. Cystisk fibros, Duchennes muskeldystrofi och sicklecellanemi liknande genterapier befinner sig nu i den sista kliniska prövningsfasen och är redo att användas på patienter.

I genterapin ersätts en felaktig, icke-fungerande eller muterad gen med den vilda genen med hjälp av samma teknik som förklaras ovan.

Vi har täckt fantastiska artiklar om genterapi, läs dem här:

1. Genterapi: Typer, vektorer, process, tillämpningar och begränsningar.
2. Vad är genterapi och hur fungerar den?
3. Naked DNA Mediated Gene Therapy
4. Sleeping Beauty Transposon System: The Future of Gene Therapy

Utöver detta används den gentekniska tekniken också vid produktion av biobränsle, sjukdomar, bioalkohol och andra viktiga produkter.

Begränsningar av genteknik:

Det finns etiska frågor som är förknippade med användningen av genterapi och genmanipulerade produkter.

För att ge ett ekonomiskt värde åt livsmedelsprodukten eller någon genetiskt modifierad produkt äventyras dessutom näringsvärdena.

På grund av den negativa effekten utvecklas nya resistenta patogena stammar snabbare.

Också biverkningarna av genterapi och användningen av virus i den är skadliga för målorganismen.

Tekniken är dyrare eftersom genterapi kostar upp till 50 000 USD.

Slutsats:

Att leka med embryot eller fostret strider mot naturlagen, men människor tror starkt på det, vilket gör att genetiskt modifierade livsmedel och växtprodukter alltid blir föremål för kontroverser.

Med hjälp av gentekniska verktyg som genterapi och genöverföringsteknik kan dock ärftliga sjukdomar och cancerliknande dödliga sjukdomar förhindras. En positiv användning av genteknik kan förändra mänsklighetens öde.

Källor:

1. National Research Council (USA) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health. Säkerheten hos genetiskt modifierade livsmedel: Metoder för att bedöma oavsiktliga hälsoeffekter. Washington (DC): National Academies Press (US); 2004. 2, Metoder och mekanismer för genetisk manipulering av växter, djur och mikroorganismer.
2. Wallace RB. Principer för genmanipulation. En introduktion till genteknik. Studier i mikrobiologi. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.