PMC
Användning av NEBcutter
NEBcutter accepterar en inmatningssekvens, som kan klistras in, hämtas från en lokal fil eller hämtas från NCBI som en GenBank-fil via dess accessionnummer. Olika alternativ är tillgängliga för att välja storleken på de ORF:er som ska visas och den uppsättning restriktionsenzymer som ska användas. Programmet beräknar positionerna för alla restriktionsenzymplatser, med undantag för dem som eventuellt kan blockeras av överlappande metylering, och hittar ORF:erna i sekvensen. Det visar sedan ett schematiskt diagram över sekvensen, de långa ORF:erna, baserat på de regler som beskrivs i Metoderna och alla restriktionsenzymer som skär den bara en gång. Den inledande visningen visar också de enzymer som kan användas i en fullständig digest för att skära bort varje ORF som visas. Figur Figur11 visar en typisk digest, i det här fallet en linjär vy av plasmidet pBR322. Om den ursprungliga DNA-sekvensen är cirkulär erbjuds både linjära och cirkulära visningar. Från den första visningen finns det många alternativ för att gå vidare, inklusive skräddarsydd digestion med valfria enzymer och olika visningar av digesten. Det är också möjligt att från linjära visningar zooma in på en utvald del av sekvensen för att få en mer detaljerad bild. Ett alternativ gör det möjligt att välja en viss region och visa de enzymer som skär i omedelbar anslutning till regionen. Detta är användbart för att hitta enzymer som kan skära bort den önskade regionen. Om zoomning leder till en region på <60 nukleotider visas den faktiska sekvensen (Fig. (Fig.2),2), tillsammans med eventuell översättning som är lämplig. På denna visning visas alla enzymer som skär sekvensen, alla baser som utgör delar av ett restriktionsenzyms igenkänningssekvens är markerade och om man för musen över ett enzymnamn får man fram en ruta med igenkänningssekvensen noterad och själva sekvensen blir understruken i visningen.
Den linjära visningen av en digestning av plasmidet pBR322. Observera att de två huvudsakliga ORF:erna är flankerade av platser (MseI och PflMI; BspHI och EarI) som skulle kunna användas för att skära bort dem från den fullständiga plasmidsekvensen. I denna visning visas endast enzymer som klyver sekvensen en gång. Alternativ för ytterligare digestion och visning finns tillgängliga via knapparna längst ner i displayen.
Zoomad visning av en kort region från pBR322. Observera att de baser som är markerade med rött och blått utgör delar av restriktionsenzymers igenkänningsställen. De röda är entydiga, medan de blå är degenererade baser. BsiEI känner alltså igen sekvensen CGRYCG. De yttre CG-resterna är invarianta, medan de inre baserna är degenererade och, i den specifika sekvensen som visas, är GT. Baser som visas i svart ingår inte i någon av restriktionsenzymernas igenkänningsställen. Denna visning kan vara användbar för att hitta restriktionsenzymer som kan särskilja SNP-alleler.
Om man för musen över ett restriktionsenzymnamn på en huvuddisplay visas dess igenkänningssekvens och det exakta basnummer vid vilket det klyvs. Om det finns mer än en plats för enzymet är alla andra platser understrukna. Om man klickar på enzymnamnet visas en sida med en sammanfattning av information om enzymet, inklusive dess metyleringskänslighet, de typer av ändar som produceras, isoschizomerer som finns tillgängliga och en lista över andra enzymer som kan producera kompatibla ändar. För NEB-enzymer ges information om digestionsförhållanden och en länk till NEB:s webbplats.
En viktig egenskap hos NEBcutter är att den innehåller allt som registrerats i REBASE om metyleringskänsligheten hos något av de enzymer som visas när de överlappar en Dam-plats (GATC), en Dcm-plats (CCWGG), en CpG-plats, en EcoKI-plats (AACN6GTGC) eller en EcoBI-plats (TGAN8TGCT). När teoretiska digestningar utförs innehåller resultaten en jämförelse av effekterna av metylering som markerar de band som förskjuts (Fig. (Fig.33).
En teoretisk digest som visar effekterna av överlappande Dcm-metylering på MscI-platserna (igenkänningssekvens: TGGCCA) som finns i sekvensen om bakteriofagen lambda hade odlats i en E.coli-stam som uttrycker Dcm-metyltransferaset (igenkänningssekvens: CCWGG). Fragment som påverkas av Dcm-metylering visas i rött. Den virtuella gelen är baserad på interpolering av en kubisk spline-kurva som genererats från experimentella data som producerats med fragment av känd storlek.
På varje sida finns hotlänkar som leder tillbaka till huvudsidan, ger hjälp med att tolka visningen eller gör det möjligt för användarna att skicka kommentarer tillbaka till författarna. Gränssnittet har utformats för att vara så intuitivt som möjligt och för att ge enkel tillgång till de viktigaste funktionerna som är användbara för forskare som försöker klyva sitt DNA. Den nuvarande versionen av NEBcutter har bearbetat mer än 400 000 sekvenser från användare. Vi förbereder för närvarande ett antal förbättringar av NEBcutter och version 2.0 är planerad att släppas den 1 juli.