Generering av knockoutmöss

Tekniker som används för att generera knockoutmöss inkluderar homolog rekombination (eller gene targeting) och gene trapping. Båda tillvägagångssätten innebär att man använder embryonala stamceller (ES-celler) från musembryon som isoleras från musembryon cirka fyra dagar efter befruktningen. I den första metoden, homolog rekombination, introduceras artificiellt DNA med flankerande sekvenser som är homologa (identiska) med de sekvenser som förekommer uppströms och nedströms från DNA-sekvensen för målgenen i kärnan av en mus ES-cell. ES-cellen känner igen de homologa flankerande sekvenserna och byter ut det befintliga målgen-DNA:t mot segment av det främmande DNA:t. Det främmande DNA:t är dock inaktivt. Genom att det införlivas i ES-cellens arvsmassa inaktiveras eller slås målgenen ut. Det främmande DNA:t är vanligtvis konstruerat så att det bär på en reportergen som markerar eller märker den befintliga genens plats, vilket gör det möjligt för forskarna att spåra dess närvaro i muscellens arvsmassa när cellerna förökar sig. Homolog rekombination är den metod som väljs när det krävs att en specifik allel (gen) ersätts av en konstruerad DNA-sekvens utan att påverka andra gener i genomet.

Gene trapping använder sig också av artificiellt DNA som bär på en reportergen. Men i stället för att rikta in sig på en specifik gen införlivas det främmande DNA:t slumpmässigt i vilken gen som helst i musens ES-cellsgenom. Den främmande sekvensen hindrar den störda genen från att koda sina proteinprodukter och gör därmed genen inaktiv. Aktiveringen av reportergenen efter inkorporering i ES-cellens arvsmassa gör det möjligt för forskare att spåra genaktivitet och härleda den störda genens funktion.

Konstgjorda DNA-sekvenser introduceras vanligtvis i musens ES-celler med hjälp av ett retrovirus eller en annan viral vektor, och de modifierade ES-cellerna odlas sedan i cellkulturer. Efter några dagar injiceras cellerna i tidiga musembryon, som sedan implanteras i livmodern hos en surrogatkvinna, där de så småningom utvecklas och föds upp till livmodern. De musungar som föds på detta sätt innehåller både modifierad och icke-modifierad vävnad och är därför inte fullständiga knockout-möss. För att generera ett par riktiga knockoutmöss (homologa knockouts) måste mössen födas upp under flera generationer. Inledningsvis korsas djuren med andra möss för att producera heterozygota individer (möss med en kopia av målgenen); heterozygota djur korsas sedan med varandra för att producera homozygoter.