Genmålsättning i embryonala stamceller

Med hjälp av genmålsättning i ES-celler kan potentiellt vilken genetisk önskad genetisk manipulering som helst föras in i könscellerna hos möss. Specifika gensekvenser kan raderas antingen konstitutivt eller villkorligt (Knock-out), specifika mutationer eller basparförändringar kan göras exakt inom en gen av intresse och reportergener eller andra uttryckskassetter kan införas på definierade platser inom genomet (Knock-in). Murina sekvenser kan bytas ut mot mänskliga sekvenser med hjälp av denna teknik för att generera humaniserade musmodeller.

Denna teknik kan ta upp till ett års utvecklingstid, så det är viktigt att investera mycket tid i början av projektet för att se till att den lämpligaste tekniken och genetiska strategin väljs för den önskade modellen. Den transgena kärnan kan tillhandahålla rådgivning för dessa typer av beslut och det är viktigt att alla målinriktningsprojekt diskuteras i detalj med kärnan innan arbetet påbörjas i laboratoriet.

När en strategi har beslutats konstrueras en målinriktningsvektor och en robust screeningstrategi utformas och testas för att säkerställa att den erforderliga genomiska manipuleringen kan detekteras på genomisk nivå. Målvektorn transfekteras sedan i ES-celler och rekombinanta kloner screenas för den önskade homologa rekombinationshändelsen. Dessa celler injiceras sedan i preimplantatembryon och de chimära möss som blir resultatet används för avel av den genetiskt modifierade muslinjen.

Tjänst

En flexibel tjänst erbjuds som kan delas upp i de specifika stadierna i modellutvecklingen, beroende på de tillgängliga resurserna.

Projektstart – kostnadsfritt

• Konsultation med gruppen för att ta itu med en lämplig teknik för att uppnå en säker, användbar modell
• Screening av genfångstdatabaser för redan existerande ES-cellkloner
• Screening av Knock-out-konsortiets resurser för redan existerande målvektorer, ES-cellkloner och modeller

Konsult för konstruktion av målvektorer – kostnadsfritt

• Genomisk sekvensanalys för att identifiera regioner som med stor sannolikhet kan vara användbara homologieregioner för genmålsättning
• Konsult med gruppen för att ta fram den genetiska strategi som krävs för att uppnå ett säkert resultat, användbar modell
• Konstruktion av målstyrningsvektorn tillhandahålls inte av kärnan, men kärnan kan bistå med tillhandahållande av kassetter och råd om metodik
• Etablering av screeningstrategin tillhandahålls inte av kärnan, men kärnan kan bistå med tillhandahållande av kassetter och metodik. rådgivning

Gen Targeting in Embryonic Stem cells

• Transfektion av den färdiga targetingvektorn till embryonala stamceller
• Isolering och förvaring av minst 192 oberoende rekombinanta cellkloner
• DNA-preparering och leverans av 96-brunnsplattor för screening
• Tining, expansion av putativt positiva kloner
• Tillagning av ytterligare DNA-preparat från putativt positiva kloner för bekräftelse av screening
• Karyotypanalys av målklonerna

Blastocystinjektion av ES-cellkloner

• Injektion av ES-celler i preimplantatembryon
• Generering och inhysning av chimärer i upp till tre veckor.
• Ett förslag till avelsstrategi