ABSTRACT

Före ligering måste varje Okazaki-fragment som syntetiseras på den eftersläpande strängen i eukaryoter bearbetas nukleolytiskt. Nukleasklyvning sker i samband med 5′-klaffstrukturer som genereras via strängförskjutningssyntes av DNA-polymeras delta. Minst tre DNA-nukleaser: Rad27 (Fen1), Dna2 och Exo1 har involverats i bearbetningen av Okazaki-fragmentens flikar. Varken de enskilda nukleasernas bidrag till syntesen av fördröjningssträngar eller strukturen hos de DNA-intermediärer som bildas i deras frånvaro har dock tydligt definierats in vivo. Genom att villkorligt utplåna nukleaser för laggingsträngar och direkt analysera Okazaki-fragment som syntetiseras in vivo i S. cerevisiae gör vi en systematisk utvärdering av Rad27s, Dna2s och Exo1s inverkan på syntesen av laggingsträngar. Vi finner att Rad27 bearbetar majoriteten av lagging-strängflagorna, med ett betydande ytterligare bidrag från Exo1 men inte från Dna2. När nukleaseklyvningen är nedsatt observerar vi en minskning av syntesen av strängförskjutning i motsats till den utbredda genereringen av långa Okazaki-fragment 5′-flikar, vilket förutsägs av vissa modeller. Vidare visar vi med hjälp av cellcykelbegränsade konstruktioner att både den nukleolytiska bearbetningen och ligeringen av Okazaki-fragmenten kan frikopplas från DNA-replikation och fördröjas tills efter det att syntesen av majoriteten av genomet är klar.