Genterapi för icke ärftliga sjukdomar

Det har gjorts många framsteg när det gäller identifiering av de mekanismer som är inblandade i kroniska organskador, vilket har öppnat upp möjligheter för studier av genterapi. Medan en mängd prekliniska och kliniska studier under de senaste decennierna har inriktats på att utveckla genterapi för ärftliga sjukdomar, har trots flera prekliniska studier i djurmodeller endast ett fåtal kliniska prövningar genomförts för att undersöka den terapeutiska effekten av genterapi för icke ärftliga sjukdomar. En nyligen genomförd studie visar att telomerasexpression med hjälp av AAV9-vektorer ger terapeutiska effekter i en musmodell av lungfibros . Terapin var inriktad på idiopatisk lungfibros. Det är känt att telomerer fungerar som skyddande strukturer i kromosomernas ändar och att korta telomerer har visat sig vara en av orsakerna till sjukdomsutveckling. I detta tillstånd blir telomererna för korta, vilket leder till att celldelningen upphör, vilket i sin tur leder till cellapoptos. Telomeras är ett enzym som kan omstrukturera telomerernas längd, och Povedano och hans kollegor har utvecklat en behandling med hjälp av AAV serotyp 9 för att leverera telomeras för att korrigera de korta telomererna. Eftersom AAV9 företrädesvis riktar sig mot regenerativa alveolära typ II-celler (ATII) visar AAV9-Tert-behandlade möss förbättrad lungfunktion med minskad inflammation och fibros 1-3 veckor efter vektorbehandlingen. Det är av intresse att notera att lungfibros antingen förbättrades eller försvann efter 8 veckors genterapi. AAV9-Tert-behandling leder till längre telomerer och ökad proliferation av ATII-celler samt lägre DNA-skador, apoptos och senescens.

AAV-vektordriven hjärtgenterapi växer fram som en helt ny plattform för att behandla hjärtsjukdomar . AAV-genterapi för hjärtsvikt har validerats i prekliniska studier med hjälp av djurmodeller, och de allra flesta av dessa tillvägagångssätt har genomförts för att förbättra kalciumhanteringen i kardiomyocyter. Det terapeutiska protein som användes i majoriteten av dessa studier var sarkoplasmatiskt kalcium ATPas (SERCA2a). Baserat på de positiva prekliniska resultaten genomfördes den första kliniska prövningen (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) för att leverera SERCA2a med hjälp av AAV serotype 1 vektor för att behandla patienter med avancerad hjärtsvikt . Resultatet av denna fas 1-studie var framgångsrikt utan några biverkningar och gick vidare till fas 2a-studien, som gav lovande resultat med en betydligt lägre andel biverkningar. Resultaten av den kliniska fas 2b-studien (CUPID2b-studien, NCT01643330) med samma vektor var dock en besvikelse utan någon signifikant förändring mellan behandlingsgruppen och placebogruppen . Detta har lett till att rekryteringen av patienter för ytterligare två försök med AAV1.SERCA2a har avbrutits. Intressant nog finns det två nya kommande försök som syftar till att leverera S100A1 med en AAV9-vektor och en konstitutivt aktiv form av proteinfosfatas 1-inhibitorer, I1c, med en chimär kapsid med AAV2- och AAV8-serotyperna. Dessutom har AAV1, AAV6 och AAV9 visat sig vara de mest lovande AAV-serotyperna för genöverföring till hjärtat, vilket ger förhoppningar om framgångsrika genterapeutiska metoder för att behandla hjärtsvikt i framtiden.

AAV-medierade genterapeutiska metoder för att behandla neuropatisk smärta hos gnagare har också rapporterats . Fischer och medarbetare har visat att administrering av rAAV som uttrycker Ca2+ kanalbindande domän 3 (CBD3) genen signifikant minskade smärtbeteende som hyperalgesi efter beröring med en nål eller känslighet för aceton-stimulering i djurmodeller av inflammatorisk och neuropatisk smärta . En annan studie med AAV9-vektor som kodar för kort hårnåls-RNA (shRNA) mot vanilloidreceptor 1 (TRPV1), som är en viktig målgen för akut smärta, visade att terapin dämpade termisk allodyni orsakad av nervskada (ökad respons hos neuronerna) 10-28 dagar efter behandling i en musmodell av sparad nervskada (SNI) . Dessa resultat ger positiva bevis som uppmuntrar forskare inom genterapi att utveckla AAV-vektorbaserade behandlingar för patienter med kronisk/diabetisk neuropatisk smärta.

Ansevärda framsteg har gjorts när det gäller genterapi för att behandla kronisk leverfibros. Även om angiotensinkonverterande enzymhämmare (ACE) eller angiotensinreceptorblockerare (ARB) används i stor utsträckning som behandlingar hos patienter med högt blodtryck har de prövats hos patienter med kronisk leversjukdom, men resultaten var inte övertygande, främst på grund av att de ger negativa systemiska biverkningar. På grund av bristen på medicinska behandlingar har levertransplantation oundvikligen blivit det enda alternativet för patienter med leversjukdom i slutstadiet till följd av kronisk leverfibros och/eller skrumplever. Dessutom innebär den ökande förekomsten av kronisk leversjukdom, bristen på donatororgan, komplikationer efter transplantation och den höga kostnaden för levertransplantation att det finns ett stort behov av att upptäcka och formulera specifika, effektiva, säkra och billiga nya terapier för leverfibros/cirrhos.

Ett möjligt tillvägagångssätt för att kringgå detta är att utveckla organinriktade antifibrotiska strategier. Studier från vårt laboratorium tyder på att en möjlig måltavla är den ”alternativa axeln” i renin-angiotensinsystemet (RAS), som omfattar dess nyckelenzym angiotensinkonverterande enzym 2 (ACE2), som bryter ner den potenta profibrotiska oktapeptiden angiotensin II (Ang II) till en antifibrotisk heptapeptid, angiotensin-(1-7) (Ang-(1-7)) . Bevis från djurförsök visade att rekombinant humant ACE2 (rhACE2) är fördelaktigt för att förebygga hypertoni vid kardiovaskulära sjukdomar och för att förbättra njurfunktionen vid diabetisk nefropati . Intressant nog tolererades rhACE2 väl av en grupp friska frivilliga människor i en klinisk fas 1-studie, utan att ge några oönskade kardiovaskulära biverkningar . Det finns en studie som rapporterade terapeutiska effekter av rekombinant ACE2 vid experimentell leverfibros, där leverskadan inducerades kirurgiskt genom kolestasis eller genom hepatotoxisk injektion av koltetraklorid . De visade att rekombinant ACE2 signifikant minskade leverfibros i båda djurmodellerna av leversjukdom . En stor nackdel med detta systemiska tillvägagångssätt är dock att behandlingen oundvikligen ger effekter utanför målgruppen som i många fall är oönskade. Det finns alltså flera nackdelar med systemisk administrering av rekombinant ACE2. Detta inkluderar dagliga injektioner av ACE2, ett förfarande som är invasivt i en klinisk miljö och dyrt tillvägagångssätt med oönskade effekter på blodtrycksregleringen . För att kringgå detta problem skulle ett idealiskt tillvägagångssätt vara att öka de vävnadsspecifika ACE2-nivåerna i målorganet. Således förväntas organspecifik ökad ACE2-aktivitet med hjälp av en leverspecifik rekombinant AAV-vektor ge terapeutiska effekter som är begränsade till målorganet samtidigt som oönskade off-target-effekter minimeras.

Förutom användningen av leverspecifik kapsidserotyp kan specificiteten ökas ytterligare genom att konstruera vektorn med ACE2-genen under transkriptionell kontroll av en stark leverspecifik promotor, apolipoprotein E/human α1-antitrypsin. I studier som publicerats av vårt laboratorium användes en pseudotypad leverspecifik AAV-vektor (rAAV2/8) för preklinisk utvärdering och man fann att hepatisk överuttryck av murin ACE2-gen som levererades till möss varade i upp till 6 månader efter en enda intraperitoneal injektion . Vi behandlade sedan möss med en rad olika leversjukdomsmodeller, som omfattade gallfibros framkallad av gallgångsligering (BDL), toxisk skada framkallad av injektioner av koltetraklorid (CCl4) och fettleverassocierad leverfibros framkallad genom utfodring med metionin- och kolinfattig (MCD) diet med hjälp av en enda intraperitoneal injektion av rAAV2/8-ACE2 . Behandlingen gav en kraftig ökning av ACE2-uttrycket och proteinaktiviteten, som var begränsad till levern utan att påverka andra större organ. Till skillnad från ärftliga sjukdomar, t.ex. blödarsjuka B, där en relativt låg nivå av transgenuttryck i levern kan vara tillräcklig för små ökningar av FIX-nivåerna i blodet, kan storleken på det transgenuttryck som krävs för ett terapeutiskt ingripande vid icke ärftliga sjukdomar vara betydligt högre. Detta kan i sin tur utgöra en utmaning för forskare inom genterapi. Intressant nog fann vi dock i vår leverinriktade terapeutiska metod med rAAV2/8-ACE2 att ett ökat hepatiskt ACE2-uttryck minskade den hepatiska nivån av profibrotiskt Ang II med mer än 50 % jämfört med dem som behandlades med en kontrollvektor som innehöll humant serumalbumin (rAAV2/8-HSA) . En minskning av Ang II, som åtföljdes av ökade hepatiska nivåer av den antifibrotiska Ang-(1-7)-peptiden, resulterade i en markant minskning av det inflammatoriska cytokinuttrycket, vilket ledde till en djupgående minskning av hepatisk fibros i alla tre modellerna (figur 2) . Dessa studier med kortsiktiga djurmodeller har validerats ytterligare för att ge bevis för att i långsiktiga djurmodeller av gallfibros och fettleversjukdom, som ger hepatiska lesioner som är mer jämförbara med dem som ses hos patienter med sådana sjukdomar, orsakade en enda intraperitoneal injektion av rAAV2/8-ACE2 en djupgående minskning av leverfibros (figur 3). I tydlig kontrast till andra studier med AAV-vektorer fann vi att rAAV2/8-ACE2 minskade serumnivåerna av alanintransaminas (ALT) hos sjuka djur jämfört med dem som fick kontrollvektorn (rAAV2/8-HSA), vilket tyder på att vektorn i sig är säker i levern. Dessutom gav rAAV2/8-HSA (upp till 10 dagar) eller rAAV2/8-ACE2 (upp till 24 veckor) vektor som injicerades i friska möss ingen förändring av ALT-nivån i plasma, vilket bekräftar att det är osannolikt att vektorn i sig orsakar leverskador . Den schematiska framställningen av den molekylära mekanismen i samband med ACE2-genterapi med hjälp av rAAV2/8-vektor vid leverfibros visas i figur 4.

Liver-targeted gene delivery med hjälp av rAAV2/8-vektor har visat sig vara terapeutiskt lovande i vuxen lever, men deras effekter har inte undersökts ingående i den omogna levern. Även om rAAV2/8 transducerar levern hos neonatala möss med hög effektivitet är vektorn inte beständig i levern och minskar snabbt med levertillväxten . Därför kan en framgångsrik användning av rAAV2/8-medierad terapi för att behandla leversjukdomar i tidig barndom kräva återadministrering . I linje med detta visade en annan studie att behandling av ornitintranskarbamylas (OTC)-defekta neonatala möss med AAV2/8-OTC-behandling inte lyckades skydda mössen från hyperammonemi i vuxen ålder . Att producera stabil transduktion i levern under utveckling är således fortfarande en av de största utmaningarna för leverspecifik rAAV2/8 genterapi, och återadministrering av vektorerna kan vara nödvändig för att bibehålla den terapeutiska effekten i vuxen ålder efter tidig neonatal behandling.

Och även om AAV-vektorerna som används för prekliniska studier kan vara effektiva i mänsklig lever är det viktigt att välja en AAV-vektor som är specifik för humana hepatocyter och som har en förbättrad transduktionseffektivitet . Nyligen har två grupper föreslagit att man ska använda humaniserade möss som den immunsupprimerade FRG-musmodellen (Fah-/-/Rag2-/-/-/Il2rg-/-) för att identifiera den bästa rAAV-serotypen för leverriktad genterapi . Studierna i en humaniserad musmodell med över 25 % mänskliga hepatocyter gjorde det möjligt för forskarna att identifiera AAV-vektorer som är specifika för mänsklig lever, t.ex. LK-03, som härstammar från ett kapsid-DNA-shuffled AAV-bibliotek. Detta bibliotek skapades med hjälp av 10 AAV-kapsidgener. LK-03, som består av fem olika AAV-kapsider, kunde transducera primära humana hepatocyter med högre effektivitet in vitro och i en xenograftmodell för hepatocellulärt karcinom in vivo jämfört med AAV serotyp 8 . Wang och medarbetare rapporterade också en högre levertransduktionsnivå i FRG-möss med hjälp av kapsid av AAVrh10, en AAV av klass E som härstammar från rhesusmakaker, och AAV3B och har visat att AAV-LK-03-vektorerna kan vara överlägsna AAV3B eller AAV8. Forskarna förväntas i allt större utsträckning använda humaniserade djurmodeller för andra sjukdomar än leversjukdomar, vilket kommer att göra det möjligt för dem att identifiera nya varianter av konstruerade AAV-vektorer, transduktionseffektivitet och immunreaktioner som är specifika för den mänskliga vävnad som undersöks. Dessutom har det rapporterats att AAV3B-eGFP-vektorn, som kunde orsaka leverspecifikt robust GFP-uttryck i levern hos icke-mänskliga primater, är betydligt bättre än AAV8 utan någon uppenbar hepatotoxicitet .