Întrebări frecvente (FAQ) despre plasmidele lentivirale

Care este diferența dintre sistemele lentivirale de generația a 2-a și a 3-a?

Pentru o descriere completă a lentivirusurilor de generația a 2-a și a 3-a, vă rugăm să consultați secțiunea de mai sus despre generația a 2-a vs generația a 3-a. Pe scurt, sistemele lentivirale de a 2-a generație utilizează mai multe proteine HIV (pe mai puține plasmide) pentru a produce particule lentivirale funcționale decât sistemele de a 3-a generație.

• Sistemele de împachetare din a doua generație: exprimă genele HIV gag, pol, rev și tat, toate dintr-o singură plasmidă de împachetare, cum ar fi psPAX2.
• Sistemele de împachetare din a treia generație: exprimă gag și pol dintr-o plasmidă de împachetare și rev din alta, cum ar fi pMDLg/pRRE și pRSV-Rev. Sistemele de împachetare din a treia generație NU exprimă tat. Sistemele lentivirale din a treia generație sunt considerate mai sigure decât cele din a doua generație, dar pot fi mai dificil de utilizat deoarece necesită transfecția cu patru plasmide separate pentru a crea particule lentivirale funcționale.

IMPORTANT : O plasmidă de transfer din a treia generație poate fi utilizată cu un sistem de ambalare din a doua generație, dar o plasmidă de transfer din a doua generație nu poate fi utilizată cu un sistem de ambalare din a treia generație.

Care este diferența dintre un lentivirus și un retrovirus?

Lentivirusurile sunt un subtip de retrovirus. Din punct de vedere experimental, principala diferență între lentivirusuri și retrovirusurile standard (γ-retrovirusuri) este că lentivirusurile sunt capabile să infecteze tipuri de celule care nu se divid și care se divid în mod activ, în timp ce retrovirusurile standard pot infecta numai tipuri de celule active din punct de vedere mitotic. Acest lucru înseamnă că lentivirusurile pot infecta o varietate mai mare de tipuri de celule decât retrovirusurile.

Atât lentivirusurile, cât și retrovirusurile standard utilizează genele gag, pol și env pentru împachetare; cu toate acestea, sunt virusuri diferite și, prin urmare, utilizează izoforme ușor diferite ale acestor componente de împachetare. Prin urmare, este posibil ca lentivirusul să nu fie ambalat eficient de către sistemele de ambalare retrovirale și viceversa.

Ce tulpină bacteriană ar trebui utilizată pentru clonarea și producerea plasmidelor mele lentivirale?

Datorită repetițiilor terminale lungi întâlnite în plasmidele lentivirale, recomandăm utilizarea unei tulpini care reduce frecvența recombinării omoloage a regiunilor instabile, cum ar fi Invitrogen Stbl3™ sau NEB Stable cells. Acest lucru va asigura menținerea repetițiilor și, adesea, duce la un randament mai mare de ADN. Cu toate acestea, în cazul în care plasmidul conține o casetă Gateway care conține gena ccdB, este necesară o tulpină de supraviețuire ccdB.

Ce linie celulară trebuie folosită pentru a produce lentivirus?

Pentru a produce lentivirus se folosesc de obicei celule 293T. Linia celulară 293T poate fi obținută de la GenHunter.

Ce dictează raza de acțiune a celulei gazdă lentivirale (tropism)?

Tropismul lentiviral este determinat de capacitatea proteinei învelișului viral de a interacționa cu receptorii de la suprafața celulei gazdă. Proteina de înveliș VSV-G este utilizată în mod obișnuit în producția de particule lentivirale deoarece conferă un tropism larg pentru o gamă largă de specii și tipuri de celule. Pentru mai multe informații, consultați articolul lui Cronin, et al. privind diferitele învelișuri și tropismul acestora.

Cum pot fi utilizate lentivirusurile pentru a crea linii celulare stabile?

Lentivirusurile pot fi utilizate pentru a crea linii celulare stabile în același mod ca și retrovirusurile standard. Adică, multe genomuri lentivirale au markeri selectibili, cum ar fi gena de rezistență la puromicină, care conferă rezistență la antibiotice celulelor gazdă infectate. Atunci când aceste antibiotice sunt adăugate în mediul de creștere al celulelor gazdă, ele ucid toate celulele care nu au încorporat genomul lentiviral, iar celulele care supraviețuiesc pot fi extinse pentru a crea linii celulare stabile, care au încorporat genomul lentiviral și adăpostesc informația genetică codificată de acest genom.

Multe plasmide de transfer lentiviral nu au markeri selectibili care să confere rezistență la un antibiotic, dar codifică un alt marker, cum ar fi GFP. Un cercetător poate folosi FACS pentru a selecta celulele care exprimă GFP și ulterior să extindă aceste celule într-o linie celulară.

Unde se integrează lentivirusul?

Studiile de integrare virală la nivelul întregului genom au arătat că lentivirusurile se integrează cel mai adesea în genele transcrise în mod activ și că această preferință este conservată între speciile țintă. Deși disponibilitatea cromatinei facilitează integrarea, aceasta nu explică preferința lentivirală pentru genele transcrise. Studiile care compară lentivirusul HIV și retrovirusul MMLV indică faptul că integraza virală joacă un rol în modelarea preferințelor pentru situsul de integrare. Un determinant celular major este LEDGF/p75, o proteină de fixare lentivirală care recrutează complexul de preintegrare la unitățile transcripționale și facilitează integrarea. Siturile de legare ale LEDGF/p75 sunt îmbogățite în corpurile genice și absente în cea mai mare parte în promotori și în regiunile intergenice, reflectând modelele de integrare lentivirală.

Pot fi utilizate plasmidele lentivirale în transfecții directe, spre deosebire de crearea de virusuri?

Unele (dar nu toate) plasmide de transfer lentiviral pot fi utilizate în transfecții tranzitorii pentru a obține expresia transgenei, iar cele care pot fi utilizate sunt în principal construcții de generația a treia. Plasmidele de transfer lentivirale nu sunt concepute special pentru transfecții tranzitorii. Prin urmare, este posibil ca expresia transgenei să fie limitată din cauza LTR-urilor lentivirale. Deși este posibil, nu se recomandă în mod explicit utilizarea plasmidelor de transfer lentivirale pentru transfecții simple.

Este posibil să se exprime ADNc din plasmidele de transfer lentivirale utilizate în mod normal pentru exprimarea ARNhc?

Da, este posibil, dar mai întâi trebuie modificat promotorul din plasmidul de transfer. Cele mai multe plasmide lentivirale care exprimă ARNhc, cum ar fi pLKO.1, utilizează un promotor U6 sau H1 pentru a conduce transcrierea dirijată de ARNc direcționată de ARNc. expresia ADNc necesită ARNc pol II și, prin urmare, necesită un promotor ARNc pol II, cum ar fi CMV sau RSV.

Ce tehnici pot fi folosite pentru a clona o inserție într-o plasmidă lentivirală care conține doar un singur situs de restricție?

Dacă o plasmidă de transfer lentivirală conține un singur situs de restricție, se pot folosi tehnici standard de clonare pentru a lega inserția în acest situs. În cazul în care nu este imediat fezabil să digerați și să clonați inserția dintr-un vector părinte, unele abordări posibile pentru utilizarea acestui sit includ subclonarea sau adăugarea de situsuri de restricție compatibile pe inserția de interes folosind PCR. Procesul de subclonare constă în digerarea inserției de interes din vectorul său părinte ș i ligarea într-un al doilea vector, astfel încât inserția să poată fi ulterior digerată din acest nou vector ș i clonată în vectorul lentiviral. Practic, aceasta constă în amestecarea situsurilor de restricție între vectori până când gena de interes este flancată de situsuri compatibile cu cele din vectorul în care se dorește, în cele din urmă, ligatura inserției. De multe ori, este mai ușor și mai puțin consumator de timp să se adauge pur și simplu situsuri de restricție pe inserția de interes folosind PCR. Acest lucru se realizează prin amplificarea prin PCR a secvenței inserției cu ajutorul unor primeri care conțin situsurile de restricție necesare. Locurile de restricție funcționale trebuie să se afle la un anumit număr de baze de la capetele primerilor utilizați. Alternativ, puteți lega un situs de clonare multiplă (MCS) dintr-un vector separat în situsul unic din vectorul lentiviral și să generați mai multe situsuri de restricție utile.

Pentru mai multe informații despre clonarea și modificarea unui MCS, vizitați Addgene’s Plasmid Reference and Protocol Guide.

Cum îmi clonez inserția într-un vector de transfer fără situsuri de restricție viabile, dar compatibil cu sistemul de clonare Gateway®?

Vectorii compatibili cu Gateway® utilizează recombinarea pentru a genera clone care conțin inserția de interes. Pe scurt, insertul este mai întâi clonat într-un vector de intrare la o regiune flancată de secvențe (numite attP1 și attP2) care permit insertului să se recombine cu vectorul de destinație (în acest caz, vectorul de destinație ar fi vectorul de transfer lentiviral). Vectorul de destinație conține secvențe attB cu care secvențele attP se recombină. Vizitați site-ul web al Invitrogen pentru mai multe informații despre sistemul de clonare Gateway®.

Ce probleme de siguranță înconjoară utilizarea vectorilor lentivirali?

După cum notează NIH, cele două principale probleme de siguranță în legătură cu utilizarea vectorilor lentivirali sunt:

1. Potențialul de generare a lentivirusurilor competente pentru replicare
2. Potențialul de oncogeneză

Potențialul de generare a lentivirusurilor competente pentru replicare este abordat prin proiectarea vectorilor și prin practici de laborator sigure. În ceea ce privește proiectarea vectorilor, sistemele lentivirale de generația a 2-a și a 3-a furnizate de Addgene separă componentele de transfer, înveliș și împachetare ale virusului pe vectori diferiți. Vectorul de transfer codifică gena de interes și conține secvențele care se vor încorpora în genomul celulei gazdă, dar nu poate produce particule virale funcționale fără genele codificate în vectorii de înveliș și de ambalare. Cu excepția cazului în care are loc o recombinare între vectorii de împachetare, de înveliș și de transfer, iar construcția rezultată este împachetată într-o particulă virală, nu este posibil ca virușii produși în mod normal prin aceste sisteme să se reproducă și să producă mai mulți viruși după infecția inițială. În această privință, sistemele din a treia generație sunt considerate mai sigure decât cele din a doua generație, deoarece vectorul de ambalare a fost împărțit în două plasmide separate (rezultând un sistem de patru plasmide în total). În plus, sistemele de a 3-a generație nu utilizează proteina HIV tat pentru a produce un virus de lungime completă din vectorul de transfer în timpul etapei de producție virală.

Mulți dintre vectorii de transfer lentivirali care au fost depozitați la Addgene sunt vectori de autoinactivare (SIN). Acești vectori au o deleție în 3’LTR a genomului viral care este transferată în 5’LTR după o rundă de transcriere inversă. Această deleție abolește transcrierea virusului complet după ce acesta a fost încorporat într-o celulă gazdă.

Potențialul de oncogeneză se bazează în mare măsură pe inserția specifică conținută în vectorul de transfer lentiviral (în funcție de faptul dacă este sau nu o oncogenă) și ar trebui să fie luată în considerare de la caz la caz.

Biosecuritatea ar trebui să fie întotdeauna luată în considerare în ceea ce privește natura precisă a experimentelor care se efectuează, iar biroul dumneavoastră de biosecuritate poate oferi mai multe informații cu privire la cele mai bune practici ale instituției dumneavoastră în ceea ce privește cercetarea lentivirală. NIH are informații suplimentare cu privire la considerațiile privind siguranța lentivirală.