Rezultate și discuții

Caspaza-3 și caspaza-7 prezintă o activitate diferențiată față de substraturile sintetice.

Caspaza-3 și caspaza-7 sunt amândouă activate în mod universal în timpul apoptozei, indiferent de stimulul specific care inițiază moartea, iar ambele proteaze sunt considerate pe scară largă ca fiind cele care coordonează faza de demolare a apoptozei prin clivarea unei game diverse de substraturi proteice (1, 2). Cu toate acestea, contribuția relativă a acestor proteaze la demolarea celulară rămâne în mare măsură speculativă. Caspaza-3 și caspaza-7 sunt cele mai apropiate una de cealaltă, în comparație cu alte caspaze de mamifere, dar prezintă totuși o divergență substanțială de secvențe, cu o identitate de secvență globală de 56% și o similaritate de secvență de 73% (Fig. 1A). Pentru a explora mai detaliat preferințele de substrat ale acestor caspaze, am exprimat ambele enzime ca proteine His-tagged în bacterii și le-am purificat până la omogenitate (Fig. 1B). Ambele caspaze au fost testate la situsul activ împotriva DEVD-AFC în combinație cu inhibitorul de policaspază zVAD-fmk (Fig. 1C). Pe baza datelor de titrare a situsului activ, concentrația activă a fiecărei enzime a fost normalizată pentru a permite comparații directe între aceste enzime în experimentele ulterioare (Fig. 1D). Am comparat apoi aceste caspaze în ceea ce privește capacitatea lor de a hidroliza un panel de substraturi tetrapeptidice sintetice. După cum ilustrează Fig. 1E, ambele caspaze au scindat preferențial DEVD-AFC cu o eficiență practic identică. În schimb, caspaza-3 a scindat LEHD-AFC mai eficient decât caspaza-7, sugerând că aceste proteaze posedă activități distincte față de anumite substraturi sintetice (Fig. 1E).