Materiał roślinny

Liście Strychnos spinosa Lam. zostały zebrane w styczniu 2013 roku z wioski Sakara, Zaria, Nigeria. Materiał roślinny został zidentyfikowany przez Musa Muhammada, botanika z sekcji herbarium Wydziału Nauk Biologicznych (Ahmadu Bello University, Zaria), gdzie zdeponowano okaz voucherowy (nr 900161). Zebrane liście suszono w wentylowanym pomieszczeniu wolnym od zanieczyszczeń, a następnie mielono na proszek przy użyciu młynka Macsalab (Model 2000 LAB Eriez), przechowywano w szklanym pojemniku i przed użyciem przechowywano w ciemności w temperaturze pokojowej (25 ± 3°C).

Ekstrakcja i frakcjonowanie ciecz-ciecz

Ekstrakcje acetonem, metanolem i dichlorometanem/metanolem

Odmiana metody Suffnessa & Dourosa została użyta do frakcjonowania składników obecnych w różnych ekstraktach z liści. Wysuszony proszek z liści (2 kg) macerowano trzykrotnie w acetonie (6 l), aby otrzymać ekstrakt acetonowy (AcetE, 75 g) po filtracji i usunięciu rozpuszczalnika w próżni. Pozostałości poddano dalszej maceracji w metanolu (6 l) według tej samej procedury, którą opisano powyżej dla ekstrakcji acetonem, aby otrzymać ekstrakt metanolowy (MetE, 119,2 g). Część wysuszonych sproszkowanych liści (1 kg) ekstrahowano również w mieszaninie (1/1, v/v) dichlorometan/metanol (3 l) trzykrotnie, aby po przefiltrowaniu i usunięciu rozpuszczalnika w próżni otrzymać ekstrakt dichlorometan/metanol (DcmMetE, 114 g). Część ekstraktu acetonowego (70 g) rozpuszczono i frakcjonowano w mieszaninie (1/1, v/v) chloroformu i wody, uzyskując frakcje wodną i chloroformową. Do frakcji wodnej dodano n-butanol, uzyskując frakcje n-butanolową (nButF, 25,1 g) i wodną (Wat1, 5 g). Frakcja chloroformowa została zatężona do sucha i rozpuszczona w 10% wodzie w metanolu przed ekstrakcją heksanem. Frakcję heksanową (HexF, 23,9 g) i pozostałość 10% wody w metanolu otrzymano po dodaniu n-heksanu. Udział wody w metanolu był zwiększany, aby uzyskać 35% składnik wodny w metanolu, który ostatecznie dał frakcje chloroformową (ChlF, 7,05 g) i 35% wodną (wat2, 2,8 g) po dodaniu chloroformu. Z porównawczej TLC, frakcje wody (Wat1) i 35% wody w metanolu (Wat2) zostały połączone w jedną frakcję (WatF, 7,8 g).

Ekstrakcja alkaloidów

Liście S. spinosa (1 kg) macerowano mieszaniną (96:3:1, v/v) EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml), a następnie perkolowano EtOAc, aby otrzymać ekstrakt (26 g) po usunięciu rozpuszczalnika za pomocą wyparki rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem. Ekstrakt rozpuszczono w EtOAc i ekstrahowano 4% kwasem octowym, uzyskując frakcję EtOAc (EtAcF, 20,02 g). Kwaśny roztwór (pH 3-4) został zbuforowany do pH (8-9) za pomocą Na2CO3 i trzykrotnie ekstrahowany DCM, aby po usunięciu rozpuszczalnika w próżni otrzymać surowy ekstrakt alkaloidów (AlkE, 2,8 g).

Atest przeciwdrobnoustrojowy

Mikroorganizmy i przygotowanie inokulum

Użyto trzech bakterii Gram-dodatnich, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) i Enterococcus faecalis (ATCC 29212), jednej bakterii Gram-ujemnej, Escherichia coli (ATCC 25922); oraz cztery grzyby, w tym trzy drożdże Candida albicans, Cryptococcus neoformans (izolaty zwierzęce) i Candida albicans (ATCC 10231) oraz jeden grzyb strzępkowy Aspergillus fumigatus. Część użytych szczepów grzybów wyhodowano z przypadków klinicznych grzybiczych chorób zakaźnych zwierząt, przed rozpoczęciem leczenia, w Katedrze Weterynaryjnych Chorób Tropikalnych Wydziału Nauk Weterynaryjnych. C. albicans wyizolowano od zięby grenlandzkiej, C. neoformans od geparda, podczas gdy A. fumigatus wyizolowano od kurczaka, który cierpiał na grzybicę układową.

Kultury bakteryjne i grzybicze pobierano z 24-godzinnych świeżych płytek agarowych i zaszczepiano w świeżym bulionie Sabourauda z dekstrozą (SDB) dla grzybów i bulionie Muellera-Hintona (MHB) (Fluka, Szwajcaria) dla bakterii, przed przeprowadzeniem badania. Zmętnienie zawiesiny drobnoustrojów dostosowano do standardu McFarlanda 0,5, co odpowiada stężeniom 1-5 × 108 i 1-5 × 107 cfu/ml, odpowiednio dla bakterii i grzybów. Zawiesiny drobnoustrojów były dalej rozcieńczane (1:100) w pożywce w celu uzyskania ostatecznego inokulum około 1,5 × 106 cfu/ml dla bakterii oraz 1,5 × 105 cfu/ml dla grzybów.

Określanie minimalnego stężenia hamującego

Dwukrotna metoda seryjnych mikrorozcieńczeń z fioletem tetrazolowym jako wskaźnikiem wzrostu drobnoustrojów została użyta do określenia wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla ekstraktów i frakcji przeciwko bakteriom i grzybom, jak zmodyfikowano przez Masoko i wsp. .

A 100 μl (10 mg/ml) ekstraktów i frakcji rozpuszczonych w dimetylosulfotlenku (DMSO) rozcieńczano seryjnie dwukrotnie sterylną wodą destylowaną w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych i do każdego dołka dodawano 100 μl świeżo przygotowanej hodowli drobnoustrojów w MHB lub SDB. Jako kontrolę negatywną stosowano DMSO (5%), natomiast kontrolę pozytywną stanowiły gentamycyna (1 mg/ml) i amfoterycyna B. Płytki mikrotitracyjne zamykano w plastikowych torebkach i inkubowano przez 24 h w temperaturze 37°C. Następnie do każdego dołka dodawano 40 μl 0,2 mg/ml fioletu p-jodonitrotetrazolowego (INT), a płytki mikrotitracyjne inkubowano w temperaturze 37°C. Minimalne stężenia hamujące oznaczano po 1 i 2 h dla bakterii oraz po 16 i 36 h dla grzybów. MIC określano jako najniższe stężenie hamujące wzrost drobnoustrojów, na co wskazywał spadek intensywności czerwonego zabarwienia formazanu.

Antyoksydacyjne

Aktywność antyoksydacyjną ekstraktów i frakcji z liści S. spinosa zostały określone pod względem zdolności zmiatania wolnych rodników przy użyciu 2,2′-difenylo-1-pikryhydrazylu (DPPH) i soli dwuamonowej 2,2-azino-bis (kwasu 3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowego) (ABTS).

AtestDPPH

Aktywność antyoksydacyjną przeprowadzono zgodnie z opisem Du Toit et al. z niewielkimi modyfikacjami. Próbki rozpuszczono w metanolu klasy HPLC (Sigma-Aldrich, Niemcy) i dwukrotnie seryjnie rozcieńczono do stężeń w zakresie od 1000 do 7,81 μg/ml dla ekstraktów i frakcji oraz od 40 do 0,31 μg/ml dla standardowego kwasu L-askorbinowego (Sigma, Niemcy). Krótko mówiąc, 40 μl próbek (10 mg/ml) wprowadzono do 96-studzienkowych płytek mikromiareczkowych (Bioster, Hiszpania) i dwukrotnie seryjnie rozcieńczono w metanolu. Następnie do każdej studzienki wprowadzono 160 μl (3,7 mg/100 ml) metanolowego roztworu 2,2-difenylo-1-pikryhydrazylu (DPPH) i po 30 min inkubacji w temperaturze pokojowej w ciemności zmierzono absorbancję przy długości fali 517 nm przy użyciu czytnika mikropłytek Multi-Mode (BioTek, USA). Aktywność zmiatania wolnych rodników każdej próbki i wzorca odniesienia określono jako procent inhibicji uzyskany z następującego wzoru:

Przy czym Absample oznacza absorbancję ekstraktu z DPPH, Abblank oznacza absorbancję ekstraktu bez DPPH, a Abcontrol oznacza absorbancję metanolu i DPPH. Stężenie próbek redukujących 50% wolnych rodników DPPH (IC50) określano, wykreślając procent inhibicji względem stężeń próbek. Badanie powtórzono trzykrotnie, a wyniki wyrażono jako średnie ± odchylenie standardowe.

Test ABTS

Zdolność ekstraktów i frakcji do zmiatania rodnika ABTS oznaczono metodą Re i wsp. z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, rodnik ABTS był generowany przez reakcję 7 mM roztworu ABTS i 2,45 mM roztworu nadsiarczanu potasu w temperaturze pokojowej przez 12 h. Absorbancja roztworu podstawowego rodnika ABTS była dostosowana do 7,00 ± 0,02 przy 734 nm przed użyciem. 40 μl roztworu ekstraktów lub frakcji rozpuszczonych w metanolu klasy HPLC (Sigma-Aldrich, Niemcy) wprowadzano na płytki mikromiareczkowe i wielokrotnie seryjnie rozcieńczano do stężeń w zakresie od 15,62 do 2000 μg/ml. Trolox (Sigma, Niemcy) i kwas L-askorbinowy (Sigma, Niemcy) przygotowywano w stężeniach od 200 do 1,56 μg/ml. Następnie do studzienek (z wyjątkiem ślepej próby) dodawano 160 μl roztworu ABTS i mierzono absorbancję przy długości fali 734 nm po 6 min inkubacji w temperaturze pokojowej. Trolox i kwas askorbinowy stosowano jako kontrole pozytywne, metanol jako kontrolę negatywną, a ekstrakty lub frakcje bez ABTS jako ślepą próbę. Procent inhibicji ABTS-+ i IC50 obliczono jak podano powyżej dla testu DPPH.

Atest cytotoksyczności

Cytotoksyczność ekstraktów acetonowych i frakcji wobec komórek nerki małpy Vero oceniano testem redukcji MTT, jak opisano wcześniej z niewielkimi modyfikacjami. Komórki wysiewano w gęstości 1 × 105 komórek/ml (100 μl) na 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych i inkubowano w temperaturze 37°C i 5% CO2 w nawilżonym środowisku. Po 24 h inkubacji do dołków zawierających komórki dodawano próbki (100 μl) o różnym stężeniu końcowym. Doxorubicyna została użyta jako pozytywne odniesienie. Dołączono również odpowiednią ślepą próbę kontrolną z równoważnymi stężeniami acetonu, a płytki inkubowano dalej przez 48 h w inkubatorze CO2. Następnie w każdym dołku odessano pożywkę z komórek, które przepłukano PBS, a na koniec do każdego dołka dodano świeżą pożywkę (200 μl). Następnie do każdego dołka dodawano 30 μl MTT (5 mg/ml w PBS) i inkubowano płytki w temperaturze 37°C przez 4 h. Po odessaniu pożywki z dołków dodawano DMSO w celu rozpuszczenia powstałych kryształów formazanu. Absorbancję mierzono na czytniku mikropłytek BioTek Synergy przy długości fali 570 nm. Zahamowanie wzrostu komórek dla każdego ekstraktu wyrażono w wartościach LC50, zdefiniowanych jako stężenie powodujące 50% zahamowanie żywotności komórek. Wartości indeksu selektywności (SI) obliczano dzieląc wartości cytotoksyczności LC50 przez wartości MIC (SI = LC50/MIC). Badania przeprowadzono w czterokrotnym powtórzeniu, a każdy eksperyment powtórzono trzykrotnie.

Analiza statystyczna

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a wartości wyrażono jako średnie ± odchylenie standardowe. Różnice między wartościami oceniano pod kątem istotności za pomocą analizy wariancji, a wyniki porównywano za pomocą najmniejszej istotnej różnicy Fishera (LSD) na poziomie istotności 5%.