Często zadawane pytania (FAQ) dotyczące plazmidów lentiwirusowych

Jaka jest różnica między systemami lentiwirusowymi 2. i 3. generacji?

Aby uzyskać pełny opis lentiwirusów 2. i 3. generacji, proszę zapoznać się z powyższym opisem 2. vs 3. generacji. W skrócie, systemy lentiwirusowe 2 generacji wykorzystują więcej białek HIV (na mniejszej liczbie plazmidów) w celu wytworzenia funkcjonalnych cząstek lentiwirusowych niż systemy 3 generacji.

• Systemy pakujące drugiej generacji: wyrażają geny HIV gag, pol, rev i tat wszystkie z jednego plazmidu pakującego, takiego jak psPAX2.
• Systemy pakujące trzeciej generacji: wyrażają gag i pol z jednego plazmidu pakującego i rev z innego, takiego jak pMDLg/pRRE i pRSV-Rev. Systemy pakujące trzeciej generacji NIE wyrażają tat. Systemy lentiwirusowe trzeciej generacji są uważane za bezpieczniejsze niż systemy drugiej generacji, ale mogą być trudniejsze w użyciu, ponieważ wymagają transfekcji czterema oddzielnymi plazmidami w celu utworzenia funkcjonalnych cząstek lentiwirusowych.

WAŻNE : Plazmid transferowy trzeciej generacji może być używany z systemem pakowania drugiej generacji, ale plazmid transferowy drugiej generacji nie może być używany z systemem pakowania trzeciej generacji.

Jaka jest różnica między lentiwirusem a retrowirusem?

Lentiwirusy są podtypem retrowirusa. Z doświadczalnego punktu widzenia główna różnica między lentiwirusami a standardowymi retrowirusami (γ-retrowirusami) polega na tym, że lentiwirusy są zdolne do infekowania nie dzielących się i aktywnie dzielących się typów komórek, podczas gdy standardowe retrowirusy mogą infekować tylko typy komórek aktywnych mitotycznie. Oznacza to, że lentiwirusy mogą zakażać większą różnorodność typów komórek niż retrowirusy.

Zarówno lentiwirusy, jak i standardowe retrowirusy wykorzystują geny gag, pol i env do pakowania; są to jednak różne wirusy i dlatego wykorzystują nieco inne izoformy tych składników pakowania. Dlatego, lentiwirusy mogą nie być wydajnie pakowane przez retrowirusowe systemy pakowania i odwrotnie.

Jaki szczep bakteryjny powinien być użyty do klonowania i produkcji moich plazmidów lentiwirusowych?

Ze względu na długie końcowe powtórzenia występujące w plazmidach lentiwirusowych, zalecamy użycie szczepu, który zmniejsza częstotliwość rekombinacji homologicznej niestabilnych regionów, takich jak Invitrogen Stbl3™ lub NEB Stable cells. Zapewni to, że powtórzenia zostaną zachowane i często skutkuje większą wydajnością DNA. Jednakże, jeśli plazmid zawiera kasetę Gateway zawierającą gen ccdB, konieczny jest szczep przetrwalnikowy ccdB.

Jakiej linii komórkowej należy użyć do produkcji lentiwirusów?

Komórki 293T są zwykle używane do produkcji lentiwirusów. Linia komórkowa 293T może być uzyskana z GenHunter.

Co dyktuje zasięg (tropizm) komórek gospodarza lentiwirusa?

Tropizm lentiwirusa jest określany przez zdolność białka otoczki wirusa do oddziaływania z receptorami na powierzchni komórek gospodarza. Białko otoczki VSV-G jest powszechnie stosowane w produkcji cząstek lentiwirusowych, ponieważ zapewnia szeroki tropizm w odniesieniu do wielu gatunków i typów komórek. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz artykuł Cronin, et al. na temat różnych otoczek i ich tropizmu.

Jak lentiwirusy mogą być używane do tworzenia stabilnych linii komórkowych?

Lentiwirusy mogą być używane do tworzenia stabilnych linii komórkowych w taki sam sposób jak standardowe retrowirusy. To znaczy, wiele genomów lentiwirusowych posiada wybieralne markery, takie jak gen oporności na puromycynę, nadające oporność na antybiotyki zakażonym komórkom gospodarza. Kiedy te antybiotyki są dodawane do pożywki wzrostu komórek gospodarza, zabijają one wszystkie komórki, które nie włączyły genomu lentiwirusowego, a te komórki, które przeżyły, mogą być rozszerzane w celu utworzenia stabilnych linii komórkowych, które włączyły genom lentiwirusowy i przechowują informację genetyczną zakodowaną przez ten genom.

Wiele transferowych plazmidów lentiwirusowych nie posiada wybieralnych markerów nadających odporność na antybiotyki, ale koduje inny marker, taki jak GFP. Badacz może użyć FACS do sortowania komórek wyrażających GFP i później rozwinąć te komórki w linię komórkową.

Gdzie integruje się lentiwirus?

Badania integracji wirusów w całym genomie wykazały, że lentiwirusy najczęściej integrują się z aktywnie transkrybowanymi genami, i że ta preferencja jest zachowana u różnych gatunków docelowych. Chociaż dostępność chromatyny ułatwia integrację, nie wyjaśnia ona preferencji lentiwirusów do transkrybowanych genów. Badania porównujące lentiwirus HIV i retrowirus MMLV wskazują, że wirusowa integraza odgrywa rolę w kształtowaniu preferencji miejsc integracji. Głównym determinantem komórkowym jest LEDGF/p75, lentiwirusowe białko wiążące, które rekrutuje kompleks pre-integracyjny do jednostek transkrypcyjnych i ułatwia integrację. Miejsca wiązania LEDGF/p75 są wzbogacone w ciałach genów i w większości nieobecne w promotorach i regionach intergenicznych, co odzwierciedla wzorce integracji lentiwirusowej.

Czy plazmidy lentiwirusowe mogą być używane w bezpośrednich transfekcjach w przeciwieństwie do tworzenia wirusa?

Niektóre (ale nie wszystkie) plazmidy transferu lentiwirusowego mogą być używane w transfekcjach przejściowych w celu osiągnięcia ekspresji transgenu, a te, które mogą, są głównie konstruktami trzeciej generacji. Plazmidy transferowe lentiwirusowe nie są zaprojektowane specjalnie do transfekcji przejściowej. Dlatego też ekspresja transgenu może być ograniczona z powodu lentiwirusowych LTR-ów. Chociaż jest to możliwe, nie jest jednoznacznie zalecane, aby używać plazmidów transferowych lentiwirusowych do prostych transfekcji.

Czy możliwa jest ekspresja cDNA z plazmidów transferowych lentiwirusów normalnie używanych do ekspresji shRNA?

Tak, jest to możliwe, ale najpierw należy zmodyfikować promotor w plazmidzie transferowym. Większość plazmidów lentiwirusowych wykazujących ekspresję shRNA, takich jak pLKO.1, używa promotora U6 lub H1 w celu napędzania transkrypcji shRNA kierowanej przez RNA pol III. Ekspresja cDNA wymaga RNA pol II, a zatem wymaga promotora RNA pol II, takiego jak CMV lub RSV.

Jakie techniki mogą być użyte do sklonowania wstawki do plazmidu lentiwirusowego zawierającego tylko jedno miejsce restrykcyjne?

Jeśli plazmid transferowy lentiwirusa zawiera jedno miejsce restrykcyjne, można użyć standardowych technik klonowania do ligacji wstawki do tego miejsca. Jeśli nie jest natychmiast wykonalne trawienie i klonowanie wstawki z wektora macierzystego, niektóre możliwe podejścia do użycia tego miejsca obejmują subklonowanie lub dołączanie zgodnych miejsc restrykcyjnych do wstawki zainteresowania za pomocą PCR. Proces subklonowania polega na trawieniu wstawki zainteresowania z wektora macierzystego i ligacji do drugiego wektora w taki sposób, że wstawka może być później trawienia z tego nowego wektora i klonowana do wektora lentiwirusowego. Jest to w zasadzie tasowanie miejsc restrykcyjnych pomiędzy wektorami, aż gen zainteresowania zostanie otoczony miejscami zgodnymi z tymi w wektorze, do którego ostatecznie chcemy ligować wstawkę. Często mniej czasochłonne i łatwiejsze jest po prostu dodanie miejsc restrykcyjnych do interesującego nas insertu za pomocą PCR. Jest to osiągane poprzez amplifikację PCR sekwencji insertu przy użyciu starterów, które zawierają potrzebne miejsca restrykcyjne. Funkcjonalne miejsca restrykcyjne muszą znajdować się określoną liczbę zasad od końców użytych starterów. Alternatywnie, można ligować miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) z oddzielnego wektora do pojedynczego miejsca w wektorze lentiwirusowym i wygenerować więcej użytecznych miejsc restrykcyjnych.

Aby uzyskać więcej informacji na temat klonowania i zmiany MCS, odwiedź Addgene’s Plasmid Reference and Protocol Guide.

Jak sklonować moją wstawkę do wektora transferowego bez realnych miejsc restrykcyjnych, ale kompatybilnego z systemem klonowania Gateway®?

Wektory kompatybilne z Gateway® wykorzystują rekombinację w celu wygenerowania klonów zawierających wstawkę zainteresowania. W skrócie, insert jest najpierw klonowany do wektora wejściowego w regionie otoczonym sekwencjami (zwanymi attP1 i attP2), które umożliwiają rekombinację insertu z wektorem docelowym (w tym przypadku wektor docelowy byłby wektorem transferowym lentiwirusa). Wektor docelowy zawiera sekwencje attB, z którymi rekombinują sekwencje attP. Odwiedź stronę internetową firmy Invitrogen, aby uzyskać więcej informacji na temat systemu klonowania Gateway®.

Jakie obawy dotyczące bezpieczeństwa wiążą się z użyciem wektorów lentiwirusowych?

Jak zauważono przez NIH, dwie główne obawy dotyczące bezpieczeństwa wiążące się z użyciem lentiwirusów to:

1. Potencjał do generowania replikacji-kompetentnego lentiwirusa
2. Potencjał do onkogenezy

Potencjał do generowania replikacji-kompetentnego lentiwirusa jest adresowany przez projekt wektorów i przez bezpieczną praktykę laboratoryjną. W zakresie projektowania wektorów, systemy lentiwirusowe 2. i 3. generacji dostarczane przez Addgene rozdzielają składniki transferu, otoczki i pakowania wirusa na różne wektory. Wektor transferowy koduje gen zainteresowania i zawiera sekwencje, które włączą się do genomu komórki gospodarza, ale nie może wytworzyć funkcjonalnych cząstek wirusowych bez genów zakodowanych w wektorach otoczki i pakowania. Jeżeli nie dochodzi do rekombinacji między wektorami pakowania, otoczki i przenoszenia, a powstały konstrukt jest pakowany do cząstki wirusowej, nie jest możliwe, aby wirusy normalnie wytwarzane w tych systemach replikowały się i wytwarzały więcej wirusa po pierwszym zakażeniu. Pod tym względem systemy trzeciej generacji są uważane za bezpieczniejsze niż systemy drugiej generacji, ponieważ wektor pakujący został podzielony na dwa oddzielne plazmidy (w wyniku czego otrzymano system składający się w sumie z czterech plazmidów). Ponadto, systemy trzeciej generacji nie wykorzystują białka HIV tat w celu wytworzenia wirusa o pełnej długości z wektora transferowego podczas etapu produkcji wirusa.

Wiele z lentiwirusowych wektorów transferowych, które zostały zdeponowane w Addgene to wektory samoinaktywujące się (SIN). Wektory te mają delecję w 3’LTR genomu wirusowego, która jest przenoszona do 5’LTR po jednej rundzie odwrotnej transkrypcji. Delecja ta znosi transkrypcję wirusa o pełnej długości po jego włączeniu do komórki gospodarza.

Potencjał do onkogenezy jest w dużej mierze oparty na specyficznej wstawce zawartej w lentiwirusowym wektorze transferowym (zależnej od tego, czy jest on onkogenem czy nie) i powinien być rozważany indywidualnie dla każdego przypadku.