Results and Discussion

Caspase-3 and Caspase-7 Exhibit Differential Activity Toward Synthetic Substrates.

Kaspaza-3 i kaspaza-7 są powszechnie aktywowane podczas apoptozy, niezależnie od specyficznego bodźca inicjującego śmierć, i obie proteazy są powszechnie uważane za koordynujące fazę rozbiórki apoptozy poprzez rozszczepianie różnorodnych substratów białkowych (1, 2). Jednakże, względny udział tych proteaz w niszczeniu komórek pozostaje w dużej mierze przedmiotem spekulacji. Kaspaza-3 i kaspaza-7 są najbardziej spokrewnione ze sobą w porównaniu z innymi kaspazami ssaków, ale mimo to wykazują znaczną rozbieżność sekwencji, z ogólną identycznością sekwencji 56% i podobieństwem sekwencji 73% (Ryc. 1A). Aby dokładniej zbadać preferencje substratowe tych kaspaz, poddaliśmy oba enzymy ekspresji w bakteriach jako białka znakowane His i oczyściliśmy je do homogenności (Ryc. 1B). Obie kaspazy miareczkowano w miejscu aktywnym wobec DEVD-AFC w połączeniu z inhibitorem polikaspazy zVAD-fmk (Rys. 1C). W oparciu o dane dotyczące miareczkowania miejsc aktywnych, stężenie aktywne każdego enzymu zostało znormalizowane, aby umożliwić bezpośrednie porównania między tymi enzymami w kolejnych eksperymentach (Rys. 1D). Następnie porównaliśmy te kaspazy pod względem ich zdolności do hydrolizy panelu syntetycznych substratów tetrapeptydowych. Jak pokazuje Rys. 1E, obie kaspazy preferencyjnie rozszczepiały DEVD-AFC z zasadniczo identyczną wydajnością. W przeciwieństwie do tego, kaspaza-3 rozszczepiała LEHD-AFC bardziej wydajnie niż kaspaza-7, co sugeruje, że te proteazy mają różne aktywności w stosunku do niektórych syntetycznych substratów (Rys. 1E).