Veel Gestelde Vragen (FAQ) over Lentiviral Plasmids

Wat is het verschil tussen 2e generatie en 3e generatie lentivirale systemen?

Voor een volledige beschrijving van 2e en 3e generatie lentivirale systemen, zie 2e vs 3e generatie hierboven. Kort gezegd, lentivirale systemen van de 2e generatie gebruiken meer HIV-eiwitten (op minder plasmiden) om functionele lentivirale deeltjes te produceren dan systemen van de 3e generatie.

• 2e generatie verpakkingssystemen: drukken de HIV gag-, pol-, rev- en tat-genen uit op één enkel verpakkingsplasmide zoals psPAX2.
• 3e generatie verpakkingssystemen: drukken gag en pol uit op één verpakkingsplasmide en rev op een ander, zoals pMDLg/pRRE en pRSV-Rev. 3e generatie verpakkingssystemen brengen tat NIET tot expressie. Lentivirale systemen van de derde generatie worden als veiliger beschouwd dan systemen van de tweede generatie, maar kunnen moeilijker te gebruiken zijn omdat zij transfectie met vier afzonderlijke plasmiden vereisen om functionele lentivirale deeltjes te creëren.

BELANGRIJK : Een transferplasmide van de derde generatie kan worden gebruikt met een verpakkingssysteem van de tweede generatie, maar een transferplasmide van de tweede generatie kan niet worden gebruikt met een verpakkingssysteem van de derde generatie.

Wat is het verschil tussen een lentivirus en een retrovirus?

Lentivirussen zijn een subtype van retrovirussen. Vanuit een experimenteel standpunt is het belangrijkste verschil tussen lentivirussen en standaard retrovirussen (γ-retrovirussen) dat lentivirussen in staat zijn om niet-delende en actief delende celtypes te infecteren, terwijl standaard retrovirussen alleen mitotisch actieve celtypes kunnen infecteren. Dit betekent dat lentivirussen een grotere verscheidenheid van celtypes kunnen infecteren dan retrovirussen.

Zowel lentivirussen als standaard retrovirussen gebruiken de gag-, pol-, en env-genen voor het verpakken; het zijn echter verschillende virussen en gebruiken dus licht verschillende isovormen van deze verpakkingscomponenten. Daarom is het mogelijk dat lentivirus niet efficiënt wordt verpakt door retrovirale verpakkingssystemen, en omgekeerd.

Welke bacteriestam moet worden gebruikt voor het klonen en produceren van mijn lentivirale plasmiden?

Vanwege de lange terminale herhalingen die in lentivirale plasmiden voorkomen, raden wij aan een stam te gebruiken die de frequentie van homologe recombinatie van instabiele regio’s vermindert, zoals Invitrogen Stbl3™ of NEB Stable cellen. Dit zal ervoor zorgen dat de herhalingen worden gehandhaafd en resulteert vaak in een grotere opbrengst van DNA. Als het plasmide echter een Gateway-cassette bevat die het ccdB-gen bevat, is een ccdB-overlevingsstam nodig.

Welke cellijn moet worden gebruikt om lentivirus te produceren?

293T cellen worden meestal gebruikt om lentivirus te produceren. De 293T cellijn kan worden verkregen bij GenHunter.

Wat dicteert het lentivirale gastheercelbereik (tropisme)?

Lentiviraal tropisme wordt bepaald door het vermogen van het virale envelopeiwit om te interageren met receptoren op het oppervlak van de gastheercel. Het VSV-G-omhullingseiwit wordt vaak gebruikt voor de productie van lentivirale deeltjes, omdat het voor een groot aantal soorten en celtypes tropisch is. Voor meer informatie, zie het artikel van Cronin, et al. over verschillende omhulsels en hun tropisme.

Hoe kunnen lentivirussen gebruikt worden om stabiele cellijnen te maken?

Lentivirussen kunnen gebruikt worden om stabiele cellijnen te maken op dezelfde manier als standaard retrovirussen. Dat wil zeggen, veel lentivirale genomen hebben selecteerbare markers, zoals het puromycine-resistentiegen, dat antibioticaresistentie verleent aan geïnfecteerde gastheercellen. Wanneer deze antibiotica aan het groeimedium van de gastcellen worden toegevoegd, doden zij alle cellen die het lentivirale genoom niet hebben opgenomen en de cellen die overleven kunnen worden uitgebreid om stabiele cellijnen te creëren, die het lentivirale genoom hebben opgenomen en de genetische informatie bevatten die door dat genoom wordt gecodeerd.

Veel lentivirale transferplasmiden hebben geen selecteerbare markers die resistentie tegen een antibioticum verlenen, maar coderen wel een andere marker, zoals GFP. Een onderzoeker kan FACS gebruiken om cellen te sorteren die GFP tot expressie brengen en deze cellen later uit te breiden tot een cellijn.

Waar integreert het lentivirus?

Genoomwijde studies van virale integratie hebben aangetoond dat lentivirussen het vaakst integreren in actief getranscribeerde genen, en dat deze voorkeur geconserveerd is tussen doelsoorten. Hoewel de beschikbaarheid van chromatine de integratie vergemakkelijkt, verklaart dit niet de lentivirale voorkeur voor getranscribeerde genen. Studies die het lentivirus HIV en het retrovirus MMLV vergelijken tonen aan dat het virale integrase een rol speelt in het bepalen van de voorkeur voor integratieplaatsen. Een belangrijke cellulaire determinant is LEDGF/p75, een lentiviraal tethering eiwit dat het pre-integratie complex rekruteert aan transcriptionele eenheden en de integratie vergemakkelijkt. LEDGF/p75 bindingsplaatsen zijn verrijkt in genlichamen en meestal afwezig in promotors en intergene regio’s, wat de patronen van lentivirale integratie weerspiegelt.

Kunnen lentivirale plasmiden worden gebruikt in directe transfecties in plaats van het maken van virus?

Sommige (maar niet alle) lentivirale transfer plasmiden kunnen worden gebruikt in transiënte transfecties om expressie van het transgen te bereiken, en degenen die dat kunnen zijn voornamelijk derde generatie constructen. Lentivirale transferplasmiden zijn niet specifiek voor transiënte transfecties ontworpen. Daarom kan de expressie van het transgen beperkt zijn als gevolg van de lentivirale LTR’s. Hoewel het mogelijk is, wordt het gebruik van lentivirale transferplasmiden voor eenvoudige transfecties niet uitdrukkelijk aanbevolen.

Is het haalbaar om cDNA tot expressie te brengen vanuit een lentiviraal transferplasmide dat normaal voor shRNA-expressie wordt gebruikt?

Ja, het is haalbaar, maar eerst moet de promoter in het transferplasmide worden gewijzigd. De meeste shRNA-expressie lentivirale plasmiden, zoals pLKO.1, gebruiken een U6 of H1 promotor om RNA pol III-gestuurde transcriptie van shRNAs aan te sturen. cDNA-expressie vereist RNA pol II, en vereist dus een RNA pol II promotor, zoals CMV of RSV.

Welke technieken kunnen worden gebruikt om een insert te klonen in een lentiviraal plasmide dat slechts één restrictie-site bevat?

Indien een lentiviraal transfer plasmide slechts één restrictie-site bevat, kan men standaard kloneringstechnieken gebruiken om het insert in deze site te ligeren. Als het niet onmiddellijk haalbaar om te ontleden en klonen van de insert van een moeder vector, een aantal mogelijke benaderingen van het gebruik van deze site zijn subklonering of applying compatibele restrictie sites op de insert van belang met behulp van PCR. Het proces van subklonering bestaat uit het verteren van de insert van belang van zijn moedervector en het ligeren in een tweede vector op zodanige wijze dat de insert later kan worden verteerd van deze nieuwe vector en gekloond in de lentivirale vector. Dit komt erop neer dat de restrictieplaatsen tussen de vectoren worden verschoven totdat het gen van belang wordt geflankeerd door plaatsen die compatibel zijn met die in de vector waarin men uiteindelijk de insert wil ligeren. Vaak is het minder tijdrovend en gemakkelijker om eenvoudig restrictieplaatsen op de insert van belang toe te voegen met behulp van PCR. Dit wordt bereikt door PCR amplificatie van de insertsequentie met primers die de benodigde restrictieplaatsen bevatten. De functionele restrictieplaatsen moeten zich op een bepaald aantal basen van de uiteinden van de gebruikte primers bevinden. Als alternatief kunt u een meervoudige kloneringsplaats (MCS) van een afzonderlijke vector in de enkele plaats in de lentivirale vector ligeren en meer bruikbare restrictieplaatsen genereren.

Voor meer informatie over het klonen en het wijzigen van een MCS, zie Addgene’s Plasmid Reference and Protocol Guide.

Hoe kloon ik mijn insert in een transfervector zonder levensvatbare restrictieplaatsen, maar compatibel met het Gateway®-kloneringssysteem?

Gateway®-compatibele vectoren maken gebruik van recombinatie om klonen te genereren die de insert van belang bevatten. In het kort wordt de insert eerst in een ingangsvector gekloneerd in een gebied dat wordt geflankeerd door sequenties (attP1 en attP2 genoemd) die recombinatie van de insert met de doelvector mogelijk maken (in dit geval is de doelvector de lentivirale overdrachtsvector). De doelvector bevat attB-sequenties waarmee de attP-sequenties recombineren. Bezoek de website van Invitrogen voor meer informatie over het Gateway®-kloneringssysteem.

Welke veiligheidsproblemen doen zich voor bij het gebruik van lentivirale vectoren?

Zoals opgemerkt door de NIH, zijn de twee belangrijkste veiligheidsproblemen bij het gebruik van lentivirale vectoren:

1. De mogelijkheid van generatie van replicatie-competent livirus
2. De mogelijkheid van oncogenese

De mogelijkheid van generatie van replicatie-competent livirus wordt aangepakt door het ontwerp van de vectoren en door veilige laboratoriumpraktijken. Wat het vectorontwerp betreft, scheiden de door Addgene geleverde lentivirale systemen van de 2e en de 3e generatie de transfer-, de envelop- en de verpakkingscomponenten van het virus op verschillende vectoren. De overdrachtvector codeert voor het gen van interesse en bevat de sequenties die in het genoom van de gastheercel zullen worden opgenomen, maar kan geen functionele virale deeltjes produceren zonder de genen die in de envelope- en verpakkingsvector zijn gecodeerd. Tenzij er recombinatie optreedt tussen de packaging-, envelope- en transfervectoren, en het resulterende construct tot een viraal deeltje wordt verpakt, is het voor virussen die normaliter met deze systemen worden geproduceerd, niet mogelijk om zich te repliceren en meer virus te produceren na de initiële infectie. In dit opzicht worden systemen van de derde generatie veiliger geacht dan systemen van de tweede generatie, omdat de verpakkingsvector in twee afzonderlijke plasmiden is verdeeld (waardoor het systeem in totaal uit vier plasmiden bestaat). Bovendien maken systemen van de 3e generatie geen gebruik van het HIV-eiwit tat om tijdens de virale productiefase uit de overdrachtsvector een virus van volledige lengte te produceren.

Veel van de lentivirale overdrachtvectoren die bij Addgene zijn gedeponeerd, zijn zelfinactiverende (SIN) vectoren. Deze vectoren hebben een deletie in het 3’LTR van het virale genoom, die na één ronde van omgekeerde transcriptie wordt overgebracht in het 5’LTR. Deze deletie heft de transcriptie van het volledige virus op nadat het in een gastheercel is opgenomen.

Het potentieel voor oncogenese is grotendeels gebaseerd op het specifieke insert in de lentivirale overdrachtvector (afhankelijk van de vraag of het een oncogen is of niet) en moet van geval tot geval worden bekeken.

Bioveiligheid moet altijd worden overwogen met betrekking tot de precieze aard van de experimenten die worden uitgevoerd, en uw bioveiligheidsbureau kan meer informatie verstrekken over de beste praktijken van uw instelling met betrekking tot lentiviraal onderzoek. De NIH heeft aanvullende informatie over lentivirale veiligheidsoverwegingen.