Resultaten en Discussie

Caspase-3 en Caspase-7 vertonen een differentiële activiteit ten opzichte van synthetische substraten.

Caspase-3 en caspase-7 worden beide universeel geactiveerd tijdens apoptose, ongeacht de specifieke dood-initiërende stimulus, en beide proteasen worden algemeen beschouwd als de afbraakfase van apoptose te coördineren door het klieven van een divers scala van eiwitsubstraten (1, 2). De relatieve bijdrage van deze proteasen aan de cellulaire afbraak blijft echter grotendeels speculatief. Caspase-3 en caspase-7 zijn het nauwst verwant met elkaar, vergeleken met andere zoogdier-caspasen, maar vertonen niettemin een aanzienlijke sequentie-afwijking, met een totale sequentie-identiteit van 56% en een sequentie-overeenkomst van 73% (Fig. 1A). Om de substraatvoorkeuren van deze caspases in meer detail te onderzoeken, brachten we beide enzymen tot expressie als His-getagde eiwitten in bacteriën en zuiverden deze tot homogeniteit (Fig. 1B). Beide caspases werden actief-site getitreerd tegen DEVD-AFC in combinatie met de polycaspase inhibitor zVAD-fmk (Fig. 1C). Op basis van de active-site titratiegegevens werd de actieve concentratie van elk enzym genormaliseerd om directe vergelijkingen tussen deze enzymen in latere experimenten mogelijk te maken (Fig. 1D). Vervolgens vergeleken we deze caspases in termen van hun vermogen om een panel van synthetische tetrapeptide substraten te hydrolyseren. Zoals Fig. 1E illustreert, splitsten beide caspases bij voorkeur DEVD-AFC met vrijwel identieke efficiëntie. Daarentegen splitste caspase-3 LEHD-AFC efficiënter dan caspase-7, wat suggereert dat deze proteasen verschillende activiteiten bezitten ten aanzien van bepaalde synthetische substraten (Fig. 1E).