Häufig gestellte Fragen (FAQ) zu lentiviralen Plasmiden

Was ist der Unterschied zwischen lentiviralen Systemen der 2. und 3. Generation?

Für eine vollständige Beschreibung der Lentiviren der 2. und 3. Kurz gesagt, verwenden Lentivirensysteme der 2. Generation mehr HIV-Proteine (auf weniger Plasmiden), um funktionelle lentivirale Partikel zu produzieren, als Systeme der 3. Generation.

• Verpackungssysteme der 2. Generation: exprimieren die HIV-Gag-, Pol-, Rev- und Tat-Gene alle von einem einzigen Verpackungsplasmid wie psPAX2.
• Verpackungssysteme der 3. Generation: exprimieren Gag und Pol von einem Verpackungsplasmid und Rev von einem anderen, wie pMDLg/pRRE und pRSV-Rev. Verpackungssysteme der 3. Lentivirale Systeme der dritten Generation gelten als sicherer als Systeme der zweiten Generation, können aber schwieriger zu verwenden sein, da sie eine Transfektion mit vier separaten Plasmiden erfordern, um funktionale lentivirale Partikel zu erzeugen.

WICHTIG : Ein Transferplasmid der dritten Generation kann mit einem Verpackungssystem der zweiten Generation verwendet werden, ein Transferplasmid der zweiten Generation kann jedoch nicht mit einem Verpackungssystem der dritten Generation verwendet werden.

Was ist der Unterschied zwischen einem Lentivirus und einem Retrovirus?

Lentiviren sind eine Unterart des Retrovirus. Aus experimenteller Sicht besteht der Hauptunterschied zwischen Lentiviren und Standard-Retroviren (γ-Retroviren) darin, dass Lentiviren in der Lage sind, sich nicht teilende und sich aktiv teilende Zelltypen zu infizieren, während Standard-Retroviren nur mitotisch aktive Zelltypen infizieren können. Dies bedeutet, dass Lentiviren eine größere Vielfalt an Zelltypen infizieren können als Retroviren.

Sowohl Lentiviren als auch Standard-Retroviren verwenden die gag-, pol- und env-Gene für die Verpackung; sie sind jedoch unterschiedliche Viren und verwenden daher leicht unterschiedliche Isoformen dieser Verpackungskomponenten. Daher kann es sein, dass Lentiviren von retroviralen Verpackungssystemen nicht effizient verpackt werden und umgekehrt.

Welcher Bakterienstamm sollte für das Klonen und die Produktion meiner lentiviralen Plasmide verwendet werden?

Aufgrund der langen terminalen Wiederholungen in lentiviralen Plasmiden empfehlen wir die Verwendung eines Stammes, der die Häufigkeit der homologen Rekombination instabiler Regionen reduziert, wie z. B. Invitrogen Stbl3™ oder NEB Stable cells. Dies stellt sicher, dass die Wiederholungen erhalten bleiben, und führt oft zu einer höheren DNA-Ausbeute. Wenn das Plasmid jedoch eine Gateway-Kassette enthält, die das ccdB-Gen enthält, ist ein ccdB-Überlebensstamm erforderlich.

Welche Zelllinie sollte für die Herstellung von Lentiviren verwendet werden?

Für die Herstellung von Lentiviren werden normalerweise 293T-Zellen verwendet. Die 293T-Zelllinie kann von GenHunter bezogen werden.

Was bestimmt die Reichweite von Lentiviren auf der Wirtszelle (Tropismus)?

Der Tropismus von Lentiviren wird durch die Fähigkeit des viralen Hüllproteins bestimmt, mit Rezeptoren auf der Oberfläche der Wirtszelle zu interagieren. Das VSV-G-Hüllprotein wird in der Regel für die Herstellung lentiviraler Partikel verwendet, da es einen breiten Tropismus für eine Reihe von Spezies und Zelltypen verleiht. Weitere Informationen finden Sie in dem Artikel von Cronin et al. über verschiedene Hüllproteine und deren Tropismus.

Wie können Lentiviren zur Herstellung stabiler Zelllinien verwendet werden?

Lentiviren können zur Herstellung stabiler Zelllinien auf die gleiche Weise verwendet werden wie Standard-Retroviren. Das heißt, viele lentivirale Genome haben selektierbare Marker, wie das Puromycin-Resistenzgen, das den infizierten Wirtszellen eine Antibiotikaresistenz verleiht. Wenn diese Antibiotika dem Wachstumsmedium der Wirtszellen zugesetzt werden, töten sie alle Zellen ab, die das lentivirale Genom nicht inkorporiert haben, und die Zellen, die überleben, können expandiert werden, um stabile Zelllinien zu schaffen, die das lentivirale Genom inkorporiert haben und die von diesem Genom kodierte genetische Information beherbergen.

Viele lentivirale Transferplasmide haben keine selektierbaren Marker, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum verleihen, kodieren aber für einen anderen Marker, wie z. B. GFP. Ein Forscher kann FACS verwenden, um Zellen zu sortieren, die GFP exprimieren, und diese Zellen später zu einer Zelllinie erweitern.

Wo integrieren sich Lentiviren?

Genomweite Studien zur viralen Integration haben gezeigt, dass sich Lentiviren am häufigsten in aktiv transkribierte Gene integrieren und dass diese Vorliebe bei allen Zielarten gleich ist. Die Verfügbarkeit von Chromatin erleichtert zwar die Integration, erklärt aber nicht die Vorliebe der Lentiviren für transkribierte Gene. Studien, in denen das Lentivirus HIV und das Retrovirus MMLV verglichen wurden, deuten darauf hin, dass die virale Integrase eine Rolle bei der Gestaltung der Integrationsstellen spielt. Eine wichtige zelluläre Determinante ist LEDGF/p75, ein lentivirales Tethering-Protein, das den Prä-Integrationskomplex an Transkriptionseinheiten rekrutiert und die Integration erleichtert. LEDGF/p75-Bindungsstellen sind in Genkörpern angereichert und in Promotoren und intergenen Regionen meist nicht vorhanden, was die Muster der lentiviralen Integration widerspiegelt.

Können lentivirale Plasmide in direkten Transfektionen im Gegensatz zur Virusherstellung verwendet werden?

Einige (aber nicht alle) lentivirale Transferplasmide können in transienten Transfektionen verwendet werden, um die Expression des Transgens zu erreichen, und bei denjenigen, die dies können, handelt es sich hauptsächlich um Konstrukte der dritten Generation. Lentivirale Transferplasmide sind nicht speziell für transiente Transfektionen konzipiert. Daher kann es aufgrund der lentiviralen LTRs zu einer begrenzten Transgenexpression kommen. Obwohl es möglich ist, wird die Verwendung von lentiviralen Transferplasmiden für einfache Transfektionen nicht ausdrücklich empfohlen.

Ist es möglich, cDNA aus einem lentiviralen Transferplasmid zu exprimieren, das normalerweise für die shRNA-Expression verwendet wird?

Ja, das ist möglich, aber zunächst muss der Promotor im Transferplasmid modifiziert werden. Die meisten shRNA-exprimierenden lentiviralen Plasmide, wie z. B. pLKO.1, verwenden einen U6- oder H1-Promotor, um die RNA pol III-gesteuerte Transkription der shRNAs zu steuern. Die cDNA-Expression erfordert RNA pol II und somit einen RNA pol II-Promotor, wie z. B. CMV oder RSV.

Welche Techniken können verwendet werden, um ein Insert in ein lentivirales Plasmid zu klonieren, das nur eine Restriktionsstelle enthält?

Wenn ein lentivirales Transferplasmid eine einzige Restriktionsstelle enthält, kann man Standardklonierungsverfahren verwenden, um das Insert an diese Stelle zu ligieren. Wenn es nicht sofort möglich ist, das Insert aus einem Elternvektor zu verdauen und zu klonieren, kann man diese Stelle auch durch Subklonierung oder Anhängen kompatibler Restriktionsstellen an das gewünschte Insert mittels PCR nutzen. Bei der Subklonierung wird das Insert von Interesse aus dem Ausgangsvektor verdaut und in einen zweiten Vektor ligiert, so dass das Insert später aus diesem neuen Vektor verdaut und in den lentiviralen Vektor kloniert werden kann. Dabei werden die Restriktionsstellen von einem Vektor zum anderen verschoben, bis das betreffende Gen von Stellen flankiert wird, die mit denen des Vektors kompatibel sind, in den man das Insert schließlich ligieren möchte. Oftmals ist es weniger zeitaufwändig und einfacher, Restriktionsstellen mit Hilfe der PCR in das gewünschte Insert einzufügen. Dies geschieht durch PCR-Amplifikation der Insertionssequenz mit Primern, die die benötigten Restriktionsstellen enthalten. Die funktionellen Restriktionsstellen müssen eine bestimmte Anzahl von Basen von den Enden der verwendeten Primer entfernt sein. Alternativ könnte man auch eine multiple Klonierungsstelle (MCS) aus einem separaten Vektor in die einzelne Stelle im lentiviralen Vektor ligieren und so mehr nützliche Restriktionsstellen erzeugen.

Weitere Informationen zum Klonen und Ändern einer MCS finden Sie im Plasmid-Referenz- und Protokollhandbuch von Addgene.

Wie klone ich mein Insert in einen Transfervektor, der keine brauchbaren Restriktionsstellen aufweist, aber mit dem Gateway®-Klonierungssystem kompatibel ist?

Gateway®-kompatible Vektoren verwenden Rekombination, um Klone zu erzeugen, die das gewünschte Insert enthalten. Kurz gesagt wird das Insert zunächst in einen Eingangsvektor an einer Region geklont, die von Sequenzen flankiert wird (attP1 und attP2 genannt), die eine Rekombination des Inserts mit dem Zielvektor ermöglichen (in diesem Fall wäre der Zielvektor der lentivirale Transfervektor). Der Zielvektor enthält attB-Sequenzen, mit denen die attP-Sequenzen rekombinieren. Weitere Informationen über das Gateway®-Klonierungssystem finden Sie auf der Website von Invitrogen.

Welche Sicherheitsbedenken bestehen bei der Verwendung von lentiviralen Vektoren?

Wie von den NIH festgestellt, sind die beiden wichtigsten Sicherheitsbedenken bei der Verwendung von Lentiviren:

1. Das Potenzial zur Erzeugung replikationskompetenter Lentiviren
2. Das Potenzial zur Onkogenese

Dem Potenzial zur Erzeugung replikationskompetenter Lentiviren wird durch das Design der Vektoren und durch sichere Laborpraxis Rechnung getragen. Was das Vektordesign betrifft, so werden bei den von Addgene angebotenen lentiviralen Systemen der 2. und 3. Generation die Transfer-, Hüll- und Verpackungskomponenten des Virus auf verschiedene Vektoren aufgeteilt. Der Transfervektor kodiert das gewünschte Gen und enthält die Sequenzen, die in das Genom der Wirtszelle eingebaut werden, kann aber ohne die in den Hüll- und Verpackungsvektoren kodierten Gene keine funktionsfähigen viralen Partikel produzieren. Wenn es nicht zu einer Rekombination zwischen den Verpackungs-, Hüll- und Transfervektoren kommt und das resultierende Konstrukt in ein Viruspartikel verpackt wird, ist es für die normalerweise von diesen Systemen produzierten Viren nicht möglich, sich zu replizieren und nach der Erstinfektion weitere Viren zu produzieren. In dieser Hinsicht gelten die Systeme der 3. Generation als sicherer als die Systeme der 2. Generation, da der Verpackungsvektor auf zwei separate Plasmide aufgeteilt wurde (was zu einem System mit insgesamt vier Plasmiden führt). Außerdem wird bei Systemen der 3. Generation das HIV-Protein tat nicht verwendet, um während der viralen Produktionsphase aus dem Transfervektor ein Virus in voller Länge zu produzieren.

Viele der lentiviralen Transfervektoren, die bei Addgene hinterlegt wurden, sind selbstinaktivierende (SIN) Vektoren. Diese Vektoren haben eine Deletion in der 3’LTR des viralen Genoms, die nach einer Runde der reversen Transkription in die 5’LTR übertragen wird. Diese Deletion hebt die Transkription des Volllängenvirus auf, nachdem es in eine Wirtszelle eingebaut wurde.

Das Onkogenese-Potenzial hängt weitgehend von dem spezifischen Insert im lentiviralen Transfervektor ab (je nachdem, ob es sich um ein Onkogen handelt oder nicht) und sollte von Fall zu Fall geprüft werden.

Die biologische Sicherheit sollte immer im Hinblick auf die genaue Art der durchgeführten Experimente berücksichtigt werden, und Ihr Büro für biologische Sicherheit kann weitere Informationen über die besten Praktiken Ihrer Einrichtung in Bezug auf lentivirale Forschung liefern. Die NIH haben weitere Informationen zu Sicherheitsüberlegungen zu Lentiviren.