Lentiviral Plasmidに関するよくある質問

第2世代と第3世代の違いは何ですか？

第2世代と第3世代のレンチウイルスについては、上記の第2 vs 第3世代のページをご参照下さい。 簡単に言うと、第2世代のレンチウイルス系は、機能的なレンチウイルス粒子を生成するために、第3世代のシステムよりも多くのHIVタンパク質を（より少ないプラスミドで）使用しています。

• 第2世代パッケージングシステム：psPAX2などの単一のパッケージングプラスミドからHIV gag、pol、rev、およびtat遺伝子をすべて発現する。
• 第3世代パッケージングシステム：pMDLg/pRREおよびpRSV-Revなどの、あるパッケージングプラスミドからgagおよびpol、別のページからrevを発現する。

重要：第3世代のトランスファープラスミドは、第2世代のパッケージングシステムで使用できますが、第2世代のトランスファープラスミドは、第3世代のパッケージングシステムで使用することができません。

レンチウイルスとレトロウイルスの違いは何ですか？

レンチウイルスはレトロウイルスの亜型です。 実験的な観点から見ると、レンチウイルスと標準レトロウイルス（γ-レトロウイルス）の主な違いは、標準レトロウイルスが有糸分裂している細胞型にしか感染できないのに対し、レンチウイルスは非分裂および活発に分裂している細胞型に感染することができる点である。 つまり、レンチウイルスはレトロウイルスよりも多様な細胞型に感染することができるのです。

レンチウイルスと標準レトロウイルスはともにパッケージングのためにgag、pol、env遺伝子を使用するが、それらは異なるウイルスであるため、これらのパッケージング成分のわずかに異なるアイソフォームを使用する。 そのため、レンチウイルスはレトロウイルスのパッケージングシステムでは効率的にパッケージングできない場合があり、その逆もまた然りである。

レンチウイルス用プラスミドのクローニングと生産には、どの細菌株を使用すべきですか。

レンチウイルス用プラスミドには長い末端リピートが見られるため、Invitrogen Stbl3™やNEB Stable細胞のような不安定な領域の相同組換えの頻度を少なくする菌株を使用するようお勧めします。 これにより、リピートが確実に維持され、多くの場合、DNAの収量も多くなる。 ただし、プラスミドにccdB遺伝子を含むゲートウェイカセットが含まれている場合は、ccdB生存株が必要である。

レンチウイルスを作製するためにどのような細胞株を使用すればよいですか？

293T細胞は通常レンチウイルスを作製するために使用されます。 293T細胞はGenHunter社から入手可能です。

レンチウイルスの宿主細胞の範囲（トロピズム）を決定するものは何ですか？

レンチウイルスのトロピズムは、ウイルスエンベロープタンパク質が宿主細胞の表面にある受容体と相互作用する能力によって決定されます。 VSV-Gエンベロープタンパク質は、様々な生物種や細胞型に対して幅広いトロピズムを与えるため、レンチウイルス粒子の製造によく使用されています。 詳細は、Cronin, et al.の論文（異なるエンベロープとそのトロピズムについて）を参照。

どのようにレンチウイルスは安定した細胞株を作るために使用できますか？

レンチウイルスは標準レトロウイルスと同じ方法で安定した細胞株を作るために使用することができます。 すなわち、多くのレンチウイルスゲノムは、感染した宿主細胞に抗生物質耐性を付与するピューロマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを有している。 これらの抗生物質を宿主細胞の増殖培地に添加すると、レンチウイルスゲノムを取り込んでいない細胞はすべて死滅し、生き残った細胞は、レンチウイルスゲノムを取り込んでそのゲノムによってコードされる遺伝情報を保有する安定した細胞株を作るために増殖させることができる。

多くのレンチウイルス導入プラスミドは、抗生物質への耐性を付与する選択マーカーを持っていませんが、GFPのような別のマーカーをコードしています。 研究者は、FACSを用いてGFPを発現する細胞を選別し、後にこれらの細胞を細胞株に拡大することができる。

レンチウイルスはどこに組み込まれるのか

ウイルス組み込みに関するゲノム規模の研究により、レンチウイルスは活発に転写されている遺伝子に最も多く組み込まれ、この優先順位は標的種間で保存されていることが示されています。 クロマチンの利用可能性は統合を促進するが、それはレンチウイルスが転写された遺伝子を好むことを説明しない。 レンチウイルスHIVとレトロウイルスMMLVを比較した研究から、ウイルスのインテグラーゼが統合部位の選好性を形成する役割を担っていることが示された。 このタンパク質は、プレインテグレートコンプレックスを転写ユニットにリクルートし、統合を促進する。 LEDGF/p75の結合部位は遺伝子ボディに多く、プロモーターや遺伝子間領域にはほとんど存在せず、レンチウイルスの統合のパターンを反映している。

レンチウイルス プラスミドは、ウイルスを作るのとは対照的に、直接トランスフェクションに使用できますか？

いくつかの（すべてではありませんが）レンチウイルス転写プラスミドは、導入遺伝子の発現を達成するための一過性トランスフェクションに使用でき、できるものは主に第3世代の構築物であります。 レンチウイルス導入プラスミドは、一過性のトランスフェクションのために特別に設計されたものではない。 したがって、レンチウイルスLTRに起因するトランスジーンの発現が制限されることがあります。 このため、レンチウイルス導入プラスミドを単純なトランスフェクションに使用することは、可能ではありますが、明確には推奨されません。

通常shRNAの発現に使用されるレンチウイルストランスファープラスミドからcDNAを発現させることは可能でしょうか。 pLKO.1などのほとんどのshRNA発現レンチウイルスプラスミドは、shRNAのRNA pol III指向性転写を駆動するために、U6またはH1プロモーターを使用しています。cDNA発現にはRNA pol IIが必要であり、CMVまたはRSVなどのRNA pol IIプロモーターが必要です。

1つの制限部位しかないレンチウィルスプラスミドに挿入物をクローニングするために、どのような技術を使用できますか？

レンチウィルス転送プラスミドに1つの制限部位がある場合、この部位に挿入物をライゲートするために標準クローニング技術を使用することができます。 親ベクターから挿入物を消化しクローニングすることが直ちに実行可能でない場合、この部位を使用するためのいくつかの可能なアプローチは、サブクローニングまたはPCRを使用して目的の挿入物に適合する制限部位を付加することである。 サブクローニングのプロセスは、目的のインサートをその親ベクターから消化し、後にこの新しいベクターから消化され、レンチウイルスベクターにクローニングされるような方法で、第2のベクターにリゲートすることからなる。 これは基本的に、目的の遺伝子が、最終的にインサートをライゲーションしたいベクターの部位と適合する部位で挟まれるまで、ベクター間で制限部位をシャッフルすることである。 多くの場合、PCRを使用して目的のインサートに制限部位を追加する方が、時間もかからず簡単である。 これは、必要な制限部位を含むプライマーを使って、インサート配列をPCRで増幅することによって達成される。 機能的な制限部位は、使用するプライマーの末端からある塩基数でなければならない。 また、別のベクターからマルチプルクローニングサイト（MCS）をレンチウィルスベクターのシングルサイトにライゲーションし、より有用な制限部位を生成することも可能です。

MCSのクローニングと変更に関する詳細については、AddgeneのPlasmid Reference and Protocol Guideをご覧ください。

制限部位がないが、Gateway®クローニングシステムと互換性のあるトランスファーベクターにインサートをクローニングするにはどうしたらよいですか？

Gateway®互換ベクターでは、目的のインサートを含むクローンを生成するために組換えを行っています。 簡単に説明すると、まずエントリーベクターの、目的ベクターとの組換えを可能にする配列（attP1、attP2と呼ばれます）に挟まれた領域にインサートがクローニングされます（この場合の目的ベクターはレンチウイルス導入ベクターとなります）。 目的ベクターには、attP配列が組み合わされるattB配列が含まれています。 Gateway® クローニングシステムの詳細については、Invitrogen 社のホームページをご覧下さい。

レンチウイルスベクターを使用する際の安全性について教えてください。

1. 複製能力のあるレンチウイルスの生成の可能性
2. 発がんの可能性

複製能力のあるレンチウイルスの生成の可能性は、ベクターの設計と安全な実験方法によって対処されています。 ベクターの設計に関しては、Addgene社が提供する第2世代および第3世代のレンチウイルスシステムでは、ウイルスのトランスファー、エンベロープ、パッケージングの各成分を異なるベクターに分離しています。 トランスファーベクターは目的の遺伝子をコードし、宿主細胞ゲノムに組み込まれる配列を含むが、エンベロープおよびパッケージングベクターにコードされた遺伝子がなければ機能的なウイルス粒子を生成することはできない。 パッケージングベクター、エンベロープベクター、トランスファーベクターの間で組換えが起こり、得られた構築物がウイルス粒子にパッケージされない限り、これらのシステムから通常生産されるウイルスが、最初の感染後に複製してより多くのウイルスを生産することは不可能である。 この点、第3世代システムは、パッケージングベクターが2つのプラスミドに分割されているため（合計4つのプラスミドシステム）、第2世代システムよりも安全性が高いと考えられている。 また、第3世代システムでは、ウイルス生産段階において、トランスファーベクターから全長ウイルスを生産するためにHIVタンパク質のtatを使用しない。

Addgeneに寄託されているレンチウイルス転送ベクターの多くは、自己不活性化（SIN）ベクターである。 これらのベクターはウイルスゲノムの3’LTRに欠失を持ち、1回の逆転写の後に5’LTRに移される。 この欠失は、ウイルスが宿主細胞に取り込まれた後、全長ウイルスの転写を停止させる。

発癌の可能性は、主にレンチウイルス転送ベクター内に含まれる特定の挿入物（それが癌遺伝子であるか否かに依存する）に基づき、ケースバイケースで考慮されるべきである。

バイオセーフティは、実施される実験の正確な性質に関して常に考慮されるべきで、所属機関のバイオセーフティ担当者は、レンチウイルス研究に関して、その機関のベストプラクティスに関する詳細情報を提供することができます。 NIHでは、レンチウイルスの安全性に関するさらなる情報を提供しています。