ヒトでは、安静時に1分間に約5～8リットルの空気が肺を出入りしています。 この空気は、酸素や二酸化炭素の濃度が変化したり、アレルゲンを含んでいたり、気道やガス交換面の機械的伸縮の程度が異なったりすることがある。 これらの信号は感知され、中継され、肺血圧の制御、免疫反応、呼吸リズムなどの生理学的出力に処理されるが、そのメカニズムは不明である。 肺神経内分泌細胞（PNEC）は、魚類から哺乳類まで幅広い生物に存在する(1)。 哺乳類の肺では、PNECは唯一の神経支配を受ける気道上皮細胞であり、肺上皮細胞全体の1%未満である(2)。 in vitroでは、PNECが酸素感知、気管支および血管の平滑筋の緊張、免疫反応に関与していることが示されているが（1、3）、in vivoではこれらの役割は証明されていない。 最近の研究では、成体におけるPNECの遺伝子切除は、恒常性や気道の修復を損なわないことが示されたが、この細胞の生体内での重要性には疑問が残る(4)。 PNECの病態、特にPNEC数の増加は、喘息、気管支肺異形成、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、先天性横隔膜ヘルニア、乳児神経内分泌過形成、乳児突然死症候群、肺高血圧など多くの肺疾患で報告されている（5-8）。

マウス肺では、ほとんどのPNECは神経上皮小体（NEB）と呼ばれる3〜20個の細胞のクラスターに存在する（3、9）。 孤立性PNECもクラスター化したPNECも、カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CGRP) などの生理活性神経ペプチドやセロトニンなどのアミンで満たされたコア小胞を密に持つ (1)． これらは、酸素濃度の変化などの刺激に応答して放出される。 神経ペプチドやアミンは、PNECと同じプロセスに関与していることが示唆されており（10-12）、これらがPNECの機能を調節している可能性がある。 しかし、生体内での因果関係は証明されていない。

我々は、免疫反応の亢進や肺高血圧症などの肺機能障害を伴う先天性横隔膜ヘルニア（CDH）のメカニズムを明らかにするために、本研究を開始した（13）。 CDHの遺伝子モデルマウスにおいて、我々はPNECのクラスター形成に失敗する欠陥を発見した。 この欠陥は、PNECの神経ペプチドの増加、免疫浸潤の増加、肺構造のリモデリングという一連のイベントによってもたらされる。 これらの知見は、PNECの機能をin vivoで証明するものである。 ヒトでは、ラウンドアバウトレセプター（ROBO）遺伝子の変異がCDHと関連している（13, 14）。 CDHに伴う肺の欠損を調べるため、我々はマウスのShhcreを用いて肺を含む内胚葉由来の上皮でRobo1とRobo2の両方を不活性化した（以下、Shhcre；Robo変異体） (15, 16)。 これらの変異体は生存しているが、生後15日目からガス交換表面積の減少が見られる（図1、A、B、および図S1）。 我々は、マイクロアレイと定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）をガス交換表面積が減少する前のP7で行った。 その結果、上位20遺伝子のうち15遺伝子が免疫反応に関与しており、Ccl3、Cxcl2、Tnfa、Saa3など、すべての遺伝子が有意に増加した（図1C）。 このシグネチャーと一致して、好中球、好酸球、マクロファージ、T細胞などの免疫細胞数の上昇が観察された（図1、D、E、および図S2）。 さらに、M2マクロファージの割合が増加し、M1マクロファージの割合が減少している（図S3）。 これらの知見は、Shhcre;Robo変異体が免疫感受性の亢進を示し、一般的なCDHの併存疾患を模倣していることを示している(13)。

Roboは肺間葉系領域で発現するが（図S4）、上皮での発現は気道に沿ってまれな細胞に限定されている（図1F）。 CGRP抗体で標識したところ、Roboを発現している上皮細胞はPNECであることがわかった（図1G）。 Robo遺伝子がPNECの機能に必要であることを確認するために、肺上皮にPNEC特異的な活性を与えるノックインcreドライバーであるAscl1creERT2（17）を用いてRoboを不活性化した（fig. S5）。 Ascl1creERT2;Robo変異体は肺胞の単純化とマクロファージの増加を示し、Shhcre;Roboの表現型が再現されることを見出した（図S6）。 これらの知見は、Roboが免疫細胞の数を制限し、肺胞の単純化を防ぐためにPNECに特異的に必要であることを示している。

胚の日 (E) 13.5 において、新しく指定されたPNECは、コントロールとShhcre; Robo突然変異体の肺の両方で単独の細胞だった（図2、AおよびB）。 E15.5までに、コントロールではPNECの大部分がNEBに凝集していた。 しかし、Shhcre;Robo変異体ではPNECsは集合していなかった（図2、CおよびD）。 この非常に浸透性の高い表現型は生後の肺でも持続した（図2、E、F、および図S7）。 Ascl1や他のPNECマーカーの正常な発現から支持されるように、PNECの総細胞数は影響を受けていないようである（図S8）。 変異体の非クラスター化した細胞は、くさび形を失い、より丸みを帯びている（図S7とS9）。 さらに、孤立性PNECが神経支配を受けていない対照群(9)とは対照的に、変異体では非集団性PNECの約33.3%（93細胞中31細胞）が神経支配を受けている（図2Fおよび図S9）。 3733>

Ascl1creERT2;Robo mutantもPNECがクラスター化しないことを示した（図S10）。 この表現型は、Roboの不活性化をNEB形成後の生後間もない時期に誘導した場合でも明らかになった。 ロボはリガンドであるSlitに依存することも独立することもできる(18)。 Slit変異体の解析では、PNECのクラスタリングはどの単一変異体でも影響を受けないが、Slit1;3変異体では減少することがわかった（図S11、AからD）。 この結果は、このプロセスにおけるRoboの機能がリガンドに依存している可能性を示唆している。

SlitとRoboは主に細胞の反発を媒介する機能を持ち、まれに引き合う機能を持つ（19）。 SlitがRoboを発現するPNECに対して斥力信号として働くか引力信号として働くかを決定するために、我々はまずSlit遺伝子がどこで発現しているかを決定した。 Slit1;2-GFP（緑色蛍光タンパク質）レポーターを併用すると、大きなNEB内の約1〜3個のPNECにのみ発現が見られ、Slit1/2発現細胞はクラスターの核形成細胞である可能性が出てきた（図S11E）。 これはまた、クラスター内のPNECのサブスペシャリティ化を示している。 Slit3の発現は、NEBが多く存在する主気管支と並走する動脈周囲の血管平滑筋細胞層に限定されている（図S11、FおよびG）。 Slit発現細胞とRobo発現PNECsが近接していることから、SlitリガンドがPNECsにとって魅力的な手がかりとなる可能性が考えられた。

これを検証するために、フローサイトメトリーで選別したGAD1-GFP+ PNECsをBoyden細胞移動培養インサートの上部チャンバーに播いた。 Slitタンパク質を上部のチャンバー内の細胞とともに添加した場合、底部に移動したPNECsは約52%減少した (P = 8.5 × 10-4) (図S12、J ～ I)。 逆に、Slitタンパク質を下部のチャンバーに添加すると、18％多く（P = 7.5 × 10-5）PNECsが下部に移動した（図S11、L〜N）。 この結果は、Slit-Roboが細胞間の引力によってPNECのNEBへの集積を促していることを示唆している。 アッセイした9つの神経ペプチド遺伝子のうち、5つがShhcre;Robo変異体で有意に発現が増加した（図3A）。 CGRPに対する抗体で染色すると、変異体のPNECではその発現は残っているものの、染色強度が増大し、もはやこれらの細胞の基底部側に限定されないことがわかった（図S7およびS9）。 また、E15.5までにunclusteringが起こったが、神経ペプチドのアップレギュレーションは出生後、おそらく空気への曝露時にのみ観察されることに注目した（図S12）。

神経ペプチドの増加が免疫応答に寄与しているかどうかを調べるために、その転写物がすべてのアッセイの中で最大の増加を示すことからCGRPに注目した(図3A）。 この増加に対して、Cgrpの変異対立遺伝子をShhcre;Roboバックグラウンドに繁殖させることで対抗した(20)。 Roboのコントロールでは、Cgrpの欠損はマクロファージ数を変化させなかった(Fig. 3, B, D, F)。 しかし、Shhcre;Robo変異体では、Cgrpの欠損は用量依存的にマクロファージ数を有意に減少させた（図3、C、E、F）。 また、Cgrpの欠損は肺胞の単純化表現型を部分的に逆転させることも見出した（図S13）。 マクロファージの増加も肺胞の単純化も完全に阻止されなかったことは、他の神経ペプチドの増加が下流の結果に加わっている可能性を示唆している。

正常な肺胞形成はP4で始まるので（21）、P15での肺胞単純化の遅い出現は、肺胞形成の崩壊が主要原因ではない可能性を示唆した。 P10までに細胞死の変化は見られなかったが、単純化の引き金となりうるエラスチンの減少（図S14）が明らかに見られた(22)。 マクロファージなどの免疫細胞は、エラスチンを分解するマトリックスメタロプロテアーゼを発現している(23)。 さらに、マクロファージの増加は単純化の前に観察されることから（図S1、S2）、因果関係がある可能性が考えられる。 これを検証するために、Shhcre;Roboと対照の肺を、マクロファージを枯渇させる親水性薬剤であるクロドロネートで処理した(24)。 免疫細胞が増加する前のP5から開始した処理により、Shhcre;Robo変異体では肺胞マクロファージの数がベースラインレベルに効果的に制限された(Fig. 4, A to E)。 これにより、エラスチンの減少が抑えられ、単純化が完全に防がれた（図4、FからJ、および図S15）。 図4 クロドロネート処理によるマクロファージの減少が肺胞の単純化を抑制する（A〜D）。 スケールバー、50μm。 (E）リポソーム対照処理した対照マウスに対して正規化した全細胞に対するマクロファージの相対的な割合としてのマクロファージの定量化。 (F〜I) P22における肺胞領域のH&E染色。 スケールバー、100μm。 (J) 平均線形切片(MLI)の定量化。 ***3733＞＜8035＞＜2746＞＜7727＞＜6663＞＜3208＞ 本研究では、PNECがその希少性にもかかわらず、生後の肺機能に深い影響を与えることを示すin vivo遺伝子証拠を提示した。 Shhcre;Robo変異体ではE15.5ですでにPNECの欠陥が明らかであるが、神経ペプチドのアップレギュレーションに始まる生理学的な結果は出生後に始まる。 このことは、PNECの影響が肺の空気への曝露に依存していることを示唆している。 このように、我々の発見は、PNECが気道壁の敏感なレオスタットであり、環境からの合図を非細胞自律的に免疫反応に変換するというシグナル伝達の様式を明らかにするものである。 また、SlitとRoboが哺乳類臓器の上皮における選択的な細胞選別の担い手であることを提示した。 NEB形成後にRoboを不活性化するとクラスター形成が解除されることから、クラスターは能動的に維持されていることが示唆された。 Slit-Robo は細胞同士の反発を仲介することがよく知られているが、今回のデータから、細胞同士の引き合いによって PNEC のクラスタリングを駆動していることが示された。 ロボの不活性化により神経支配が変化し、神経ペプチドの基底部偏在が失われた。 CDHのような稀な疾患から喘息のような一般的な疾患まで、肺に関連する多くの疾患においてPNEC数の増加が記録されている(5-8)。 Robo変異体PNECの表現型はPNEC数の増加とは異なることに注目したい。 しかし、両者とも神経ペプチドの増加と関連しており、神経ペプチドはPNECの機能に対する強力なエフェクターであることを我々は示した。 我々の発見は、それによって、疾患の受動的な読み出しであるよりもむしろ、記録されたPNECの病理と神経ペプチドの増加は、多くの呼吸器疾患の症状の積極的な貢献者としての役割を果たすかもしれないことを予測させる。 補足資料として、データおよび方法を掲載した。 X. Ai, T, Gomez, E. Chapmanの議論、N. Hernandez-Santosの免疫解析、L. Ma, M. Tessier-Lavigne, J. Johnson, L. Wadiche, M. Zylka, Mutant Mouse Regional Resource Centerのマウス系統、A. Lashuaの技術支援に感謝する。 この研究は、American Heart Association predoctoral fellowship 14PRE20490146、NIH predoctoral training grant T32 GM007133 (to K.B.)、NIAID postdoctoral fellowship 5T32AI007635 (to L.N.) 、NHLBI RO1 HL113870, HL097134, HL122406, University of Wisconsin Romnes Fellowship and Wisconsin Partnership Program grant 2897 (to X.S.) によって支援されました。