Foire aux questions (FAQ) sur les plasmides lentiviraux

Quelle est la différence entre les systèmes lentiviraux de 2e génération et de 3e génération?

Pour une description complète des lentivirus de 2e et 3e génération, veuillez revoir 2e vs 3e génération ci-dessus. Brièvement, les systèmes lentiviraux de 2ème génération utilisent plus de protéines VIH (sur moins de plasmides) afin de produire des particules lentivirales fonctionnelles que les systèmes de 3ème génération.

• Systèmes de conditionnement de 2e génération : expriment les gènes gag, pol, rev et tat du VIH tous à partir d’un seul plasmide de conditionnement tel que psPAX2.
• Systèmes de conditionnement de 3e génération : expriment gag et pol à partir d’un plasmide de conditionnement et rev à partir d’un autre, tel que pMDLg/pRRE et pRSV-Rev. Les systèmes de conditionnement de 3e génération n’expriment PAS tat. Les systèmes lentiviraux de troisième génération sont considérés comme plus sûrs que les systèmes de deuxième génération, mais peuvent être plus difficiles à utiliser car ils nécessitent une transfection avec quatre plasmides distincts afin de créer des particules lentivirales fonctionnelles.

IMPORTANT : Un plasmide de transfert de troisième génération peut être utilisé avec un système de conditionnement de deuxième génération, mais un plasmide de transfert de deuxième génération ne peut pas être utilisé avec un système de conditionnement de troisième génération.

Quelle est la différence entre un lentivirus et un rétrovirus ?

Les lentivirus sont un sous-type de rétrovirus. D’un point de vue expérimental, la principale différence entre les lentivirus et les rétrovirus standards (γ-rétrovirus) est que les lentivirus sont capables d’infecter des types de cellules qui ne se divisent pas et qui se divisent activement, alors que les rétrovirus standards ne peuvent infecter que des types de cellules mitotiquement actives. Cela signifie que les lentivirus peuvent infecter une plus grande variété de types de cellules que les rétrovirus.

Les lentivirus et les rétrovirus standard utilisent tous deux les gènes gag, pol et env pour l’empaquetage ; cependant, ce sont des virus différents et ils utilisent donc des isoformes légèrement différentes de ces composants d’empaquetage. Par conséquent, le lentivirus peut ne pas être efficacement empaqueté par les systèmes d’empaquetage rétroviral, et vice versa.

Quelle souche bactérienne utiliser pour le clonage et la production de mes plasmides lentiviraux ?

En raison des longues répétitions terminales présentes dans les plasmides lentiviraux, nous recommandons d’utiliser une souche qui réduit la fréquence de recombinaison homologue des régions instables, comme les cellules Invitrogen Stbl3™ ou NEB Stable. Cela garantira le maintien des répétitions et permet souvent d’obtenir un meilleur rendement en ADN. Cependant, si le plasmide contient une cassette Gateway contenant le gène ccdB, une souche de survie ccdB est nécessaire.

Quelle lignée cellulaire faut-il utiliser pour produire des lentivirus ?

Les cellules 293T sont généralement utilisées pour produire des lentivirus. La lignée cellulaire 293T peut être obtenue auprès de GenHunter.

Qu’est-ce qui dicte la portée des cellules hôtes lentivirales (tropisme) ?

Le tropisme lentiviral est déterminé par la capacité de la protéine d’enveloppe virale à interagir avec des récepteurs à la surface de la cellule hôte. La protéine d’enveloppe VSV-G est couramment utilisée dans la production de particules lentivirales car elle confère un large tropisme sur une gamme d’espèces et de types de cellules. Pour plus d’informations, voir l’article de Cronin, et al. sur les différentes enveloppes et leur tropisme.

Comment peut-on utiliser les lentivirus pour faire des lignées cellulaires stables ?

Les lentivirus peuvent être utilisés pour faire des lignées cellulaires stables de la même manière que les rétrovirus standards. C’est-à-dire que de nombreux génomes lentiviraux possèdent des marqueurs sélectionnables, comme le gène de résistance à la puromycine, conférant une résistance aux antibiotiques aux cellules hôtes infectées. Lorsque ces antibiotiques sont ajoutés au milieu de croissance des cellules hôtes, ils tuent toutes les cellules qui n’ont pas incorporé le génome lentiviral et les cellules qui survivent peuvent être étendues pour créer des lignées cellulaires stables, qui ont incorporé le génome lentiviral et hébergent l’information génétique codée par ce génome.

De nombreux plasmides de transfert lentiviraux n’ont pas de marqueurs sélectionnables conférant une résistance à un antibiotique, mais codent un autre marqueur, tel que la GFP. Un chercheur peut utiliser FACS pour trier les cellules exprimant la GFP et étendre ultérieurement ces cellules dans une lignée cellulaire.

Où les lentivirus s’intègrent-ils ?

Les études de l’intégration virale à l’échelle du génome ont montré que les lentivirus s’intègrent le plus souvent dans des gènes activement transcrits, et que cette préférence est conservée chez les espèces cibles. Bien que la disponibilité de la chromatine facilite l’intégration, elle n’explique pas la préférence des lentivirus pour les gènes transcrits. Des études comparant le lentivirus HIV et le rétrovirus MMLV indiquent que l’intégrase virale joue un rôle dans le façonnement des préférences de sites d’intégration. Un déterminant cellulaire majeur est LEDGF/p75, une protéine d’ancrage lentivirale qui recrute le complexe de pré-intégration aux unités de transcription et facilite l’intégration. Les sites de liaison LEDGF/p75 sont enrichis dans les corps des gènes et surtout absents dans les promoteurs et les régions intergéniques, reflétant les modèles d’intégration lentivirale.

Les plasmides lentiviraux peuvent-ils être utilisés dans des transfections directes par opposition à la fabrication de virus ?

Certains plasmides de transfert lentiviraux (mais pas tous) peuvent être utilisés dans des transfections transitoires pour obtenir l’expression du transgène, et ceux qui le peuvent sont principalement des constructions de troisième génération. Les plasmides de transfert lentiviraux ne sont pas conçus spécifiquement pour les transfections transitoires. Par conséquent, l’expression du transgène peut être limitée en raison des LTR lentiviraux. Bien que cela soit possible, il n’est pas explicitement recommandé d’utiliser des plasmides de transfert lentiviraux pour des transfections simples.

Est-il possible d’exprimer un ADNc à partir d’un plasmide de transfert lentiviral normalement utilisé pour l’expression de shRNA ?

Oui, c’est faisable, mais il faut d’abord modifier le promoteur au sein du plasmide de transfert. La plupart des plasmides lentiviraux exprimant des shRNA, tels que pLKO.1, utilisent un promoteur U6 ou H1 afin de piloter la transcription des shRNA dirigée par l’ARN pol III. L’expression de l’ADNc nécessite l’ARN pol II, et requiert donc un promoteur ARN pol II, tel que le CMV ou le RSV.

Quelles techniques peut-on utiliser pour cloner un insert dans un plasmide lentiviral ne contenant qu’un seul site de restriction ?

Si un plasmide de transfert lentiviral contient un seul site de restriction, on peut utiliser des techniques de clonage standard pour ligaturer l’insert dans ce site. S’il n’est pas immédiatement possible de digérer et de cloner l’insert à partir d’un vecteur parent, certaines approches possibles pour utiliser ce site comprennent le sous-clonage ou l’ajout de sites de restriction compatibles sur l’insert d’intérêt en utilisant la PCR. Le processus de sous-clonage consiste à digérer l’insert d’intérêt à partir de son vecteur parent et à le ligaturer dans un second vecteur de telle sorte que l’insert puisse être digéré ultérieurement à partir de ce nouveau vecteur et cloné dans le vecteur lentiviral. Il s’agit essentiellement de mélanger les sites de restriction entre les vecteurs jusqu’à ce que le gène d’intérêt soit flanqué de sites compatibles avec ceux du vecteur dans lequel on souhaite finalement ligaturer l’insert. Souvent, il est moins long et plus facile d’ajouter simplement des sites de restriction sur l’insert d’intérêt en utilisant la PCR. Pour ce faire, on amplifie par PCR la séquence d’insertion à l’aide d’amorces qui contiennent les sites de restriction nécessaires. Les sites de restriction fonctionnels doivent se trouver à un certain nombre de bases des extrémités des amorces utilisées. Alternativement, vous pourriez ligaturer un site de clonage multiple (MCS) d’un vecteur séparé dans le site unique du vecteur lentiviral et générer des sites de restriction plus utiles.

Pour plus d’informations sur le clonage et le changement d’un MCS, consultez le guide de référence et de protocole des plasmides d’Addgene.

Comment puis-je cloner mon insert dans un vecteur de transfert sans sites de restriction viables mais compatible avec le système de clonage Gateway® ?

Les vecteurs compatibles Gateway® utilisent la recombinaison afin de générer des clones contenant l’insert d’intérêt. En bref, l’insert est d’abord cloné dans un vecteur d’entrée au niveau d’une région flanquée de séquences (appelées attP1 et attP2) qui permettent à l’insert de se recombiner avec le vecteur de destination (dans ce cas, le vecteur de destination serait le vecteur de transfert lentiviral). Le vecteur de destination contient des séquences attB avec lesquelles les séquences attP se recombinent. Visitez le site Web d’Invitrogen pour plus d’informations sur le système de clonage Gateway®.

Quels problèmes de sécurité entourent l’utilisation des vecteurs lentiviraux ?

Comme l’a noté le NIH, les deux principaux problèmes de sécurité entourant l’utilisation des lentiviraux sont :

1. Le potentiel de génération de lentivirus compétents pour la réplication
2. Le potentiel d’oncogenèse

Le potentiel de génération de lentivirus compétents pour la réplication est abordé par la conception des vecteurs et par des pratiques de laboratoire sûres. En termes de conception des vecteurs, les systèmes lentiviraux de 2ème et 3ème génération fournis par Addgene séparent les composants de transfert, d’enveloppe et d’emballage du virus sur différents vecteurs. Le vecteur de transfert code le gène d’intérêt et contient les séquences qui s’incorporeront au génome de la cellule hôte, mais ne peut pas produire de particules virales fonctionnelles sans les gènes codés dans les vecteurs d’enveloppe et d’emballage. À moins qu’une recombinaison ne se produise entre les vecteurs d’encapsulation, d’enveloppe et de transfert, et que la construction résultante ne soit encapsulée dans une particule virale, il n’est pas possible pour les virus normalement produits par ces systèmes de se répliquer et de produire davantage de virus après l’infection initiale. À cet égard, les systèmes de 3e génération sont considérés comme plus sûrs que les systèmes de 2e génération, car le vecteur d’encapsulation a été divisé en deux plasmides distincts (ce qui donne un système à quatre plasmides au total). En outre, les systèmes de 3ème génération n’utilisent pas la protéine VIH tat afin de produire un virus de pleine longueur à partir du vecteur de transfert pendant l’étape de production virale.

De nombreux vecteurs de transfert lentiviraux qui ont été déposés chez Addgene sont des vecteurs auto-inactivants (SIN). Ces vecteurs ont une délétion dans la 3’LTR du génome viral qui est transférée dans la 5’LTR après un tour de transcription inverse. Cette délétion abolit la transcription du virus complet après son incorporation dans une cellule hôte.

Le potentiel d’oncogenèse est largement basé sur l’insert spécifique contenu dans le vecteur de transfert lentiviral (dépendant du fait qu’il s’agisse ou non d’un oncogène) et doit être considéré au cas par cas.

La biosécurité doit toujours être envisagée en fonction de la nature précise des expériences réalisées, et votre bureau de biosécurité peut fournir plus d’informations sur les meilleures pratiques de votre institution en matière de recherche lentivirale. Le NIH dispose d’informations supplémentaires sur les considérations de sécurité des lentiviraux.