Frequently Asked Questions (FAQ) about Lentiviral Plasmids

What is the difference between 2nd generation and 3rd generation lentiviral systems?

Täydellinen kuvaus 2. ja 3. sukupolven linssiviruksista löytyy edellä olevasta 2. vs. 3. sukupolvi. Lyhyesti sanottuna 2. sukupolven lentivirusjärjestelmissä käytetään enemmän HIV-proteiineja (pienemmällä määrällä plasmideja) toimivien lentivirushiukkasten tuottamiseksi kuin 3. sukupolven järjestelmissä.

• 2. sukupolven pakkausjärjestelmät: ilmentävät HIV:n gag-, pol-, rev- ja tat-geenejä kaikki yhdestä pakkaus-plasmidista, kuten psPAX2.
• 3. sukupolven pakkausjärjestelmät: ilmentävät gag- ja pol-geenejä yhdestä pakkaus-plasmidista ja rev-geenejä toisesta pakkaus-plasmidista, esim. pMDLg/pRRE:stä ja pRSV-Rev:stä Kolmannen sukupolven pakkausjärjestelmät EIVÄT ilmentä tat:ia. Kolmannen sukupolven lentiviraalisia järjestelmiä pidetään turvallisempina kuin toisen sukupolven järjestelmiä, mutta niiden käyttö voi olla vaikeampaa, koska ne vaativat transfektiota neljällä erillisellä plasmidilla, jotta saadaan aikaan toimivia lentiviraalisia partikkeleita.

TÄRKEÄÄ : Kolmannen sukupolven siirtoplasmidia voidaan käyttää toisen sukupolven pakkausjärjestelmän kanssa, mutta toisen sukupolven siirtoplasmidia ei voida käyttää kolmannen sukupolven pakkausjärjestelmän kanssa.

Mitä eroa on lentiviruksen ja retroviruksen välillä?

Lentivirukset ovat retroviruksen alatyyppi. Kokeellisesta näkökulmasta tärkein ero lentivirusten ja tavanomaisten retrovirusten (γ-retrovirukset) välillä on se, että lentivirukset pystyvät infektoimaan jakautumattomia ja aktiivisesti jakautuvia solutyyppejä, kun taas tavanomaiset retrovirukset pystyvät infektoimaan vain mitoottisesti aktiivisia solutyyppejä. Tämä tarkoittaa, että lentivirukset voivat infektoida useampia solutyyppejä kuin retrovirukset.

Sekä lentivirukset että tavalliset retrovirukset käyttävät pakkaamiseen gag-, pol- ja env-geenejä; ne ovat kuitenkin erilaisia viruksia ja käyttävät siten näiden pakkauskomponenttien hieman erilaisia isomuotoja. Siksi retroviruspakkausjärjestelmät eivät välttämättä pakkaa tehokkaasti lentiviruksia ja päinvastoin.

Mitä bakteerikantaa tulisi käyttää kloonaukseen ja lentiviiriplasmidieni tuottamiseen?

Koska lentiviiriplasmideissa esiintyy pitkiä terminaalisia toistoja, suosittelemme käyttämään kantaa, joka vähentää epästabiilien alueiden homologisen rekombinaation esiintymistiheyttä, kuten Invitrogenin Stbl3™- tai NEB:n Stable-soluja. Näin varmistetaan toistojen säilyminen ja saadaan usein suurempi DNA:n saanto. Jos plasmidi kuitenkin sisältää ccdB-geenin sisältävän Gateway-kasetin, tarvitaan ccdB:n selviytymiskanta.

Mitä solulinjaa tulisi käyttää lentiviruksen tuottamiseen?

293T-soluja käytetään yleensä lentiviruksen tuottamiseen. 293T-solulinjan saa GenHunterilta.

Mikä määrää lentiviruksen isäntäsolualueen (tropismi)?

Lentiviruksen tropismi määräytyy sen mukaan, miten hyvin viruksen kuoriproteiini kykenee vuorovaikutukseen isäntäsolun pinnalla olevien reseptorien kanssa. VSV-G-kuoriproteiinia käytetään yleisesti lentiviiripartikkelien tuotannossa, koska se antaa laajan trooppisuuden useille lajeille ja solutyypeille. Lisätietoja on Croninin ym. artikkelissa eri kuorista ja niiden trooppisuudesta.

Miten lentiviruksia voidaan käyttää vakaiden solulinjojen valmistukseen?

Lentiviruksia voidaan käyttää vakaiden solulinjojen valmistukseen samalla tavalla kuin tavallisia retroviruksia. Toisin sanoen monissa lentivirusten genomeissa on valikoivia markkereita, kuten puromysiiniresistenssigeeni, jotka antavat antibioottiresistenssin tartunnan saaneille isäntäsoluille. Kun näitä antibiootteja lisätään isäntäsolujen kasvualustaan, ne tappavat kaikki sellaiset solut, jotka eivät ole omaksuneet lentiviruksen genomia, ja ne solut, jotka ovat hengissä, voidaan laajentaa luodakseen stabiileja solulinjoja, jotka ovat omaksuneet lentiviruksen genomin ja sisältävät kyseisen genomin koodaamaa geneettistä informaatiota.

Monissa lentiviraalisissa siirtoplasmideissa ei ole valikoivia markkereita, jotka antavat resistenssin antibiootille, mutta ne koodaavat jotain muuta markkeria, kuten GFP:tä. Tutkija voi FACS:n avulla lajitella GFP:tä ilmentävät solut ja myöhemmin laajentaa nämä solut solulinjaksi.

Mihin lentivirus integroituu?

Koko genomin laajuiset tutkimukset virusintegraatiosta ovat osoittaneet, että lentivirukset integroituvat useimmiten aktiivisesti transkriboitaviin geeneihin ja että tämä mieltymys on konservoitunut eri kohdelajeissa. Vaikka kromatiinin saatavuus helpottaa integroitumista, se ei selitä lentivirusten mieltymystä transkriboituihin geeneihin. Tutkimukset, joissa verrataan lentsivirusta HIV:tä ja retrovirusta MMLV:tä, osoittavat, että viruksen integraasilla on merkitystä integraatiokohtien mieltymysten muodostumisessa. Tärkeä solutason määräävä tekijä on LEDGF/p75, lentiviruksen kiinnitysproteiini, joka rekrytoi pre-integraatiokompleksin transkriptioyksiköihin ja helpottaa integroitumista. LEDGF/p75:n sitoutumiskohtia on runsaasti geenirungoissa, ja ne puuttuvat enimmäkseen promoottoreista ja intergeenisiltä alueilta, mikä heijastaa lentiviruksen integraatiomalleja.

Voidaanko lentiviraaliplasmideja käyttää suorissa transfektioissa viruksen valmistamisen sijaan?

Joitakin (mutta ei kaikkia) lentiviraalisia siirtoplasmideja voidaan käyttää ohimenevissä transfektioissa transgeenin ilmentymisen aikaansaamiseksi, ja ne, joita voidaan käyttää, ovat ensisijaisesti kolmannen sukupolven konstruktioita. Lentiviraalisia siirtoplasmideja ei ole suunniteltu erityisesti ohimeneviä transfektioita varten. Siksi transgeenin ilmentyminen voi olla rajallista lentiviraalisen LTR:n vuoksi. Vaikka se on mahdollista, ei ole nimenomaisesti suositeltavaa käyttää lentiviraalisia siirtoplasmideja yksinkertaisiin transfektioihin.

Onko mahdollista ekspressoida cDNA:ta lentiviraalisista siirtoplasmideista, joita käytetään tavallisesti shRNA:n ekspressioon?

Kyllä, se on mahdollista, mutta ensin on muutettava siirtoplasmidissa olevaa promoottoria. Useimmat shRNA:ta ilmentävät lentiviraaliplasmidit, kuten pLKO.1, käyttävät U6- tai H1-promoottoria ajaakseen RNA pol III:n ohjaamaa shRNA:n transkriptiota. cDNA:n ilmentäminen edellyttää RNA pol II:ta ja siten RNA pol II:n promoottoria, kuten CMV:tä tai RSV:tä.

Mitä tekniikoita voidaan käyttää insertin kloonaamiseen lentiiviraaliplasmidiin, joka sisältää vain yhden restriktiokohdan?

Jos lentiiviraalinen siirtoplasmidi sisältää yhden restriktiokohdan, voidaan käyttää tavanomaisia kloonaustekniikoita insertin ligoimiseksi tähän kohtaan. Jos insertin pilkkominen ja kloonaaminen emovektorista ei ole välittömästi mahdollista, joitakin mahdollisia lähestymistapoja tämän kohdan käyttämiseen ovat subkloonaus tai yhteensopivien restriktiokohtien liittäminen kiinnostavaan inserttiin PCR:n avulla. Subkloonausprosessi koostuu kiinnostavan insertin pilkkomisesta emovektorista ja ligoimisesta toiseen vektoriin siten, että insertti voidaan myöhemmin pilkkoa tästä uudesta vektorista ja kloonata lentivirusvektoriin. Tämä tarkoittaa periaatteessa restriktiokohtien sekoittamista vektoreiden välillä, kunnes kiinnostava geeni on sellaisten kohtien ympäröimä, jotka ovat yhteensopivia sen vektorin kohtien kanssa, johon insertti lopulta halutaan ligatoida. Usein on vähemmän aikaa vievää ja helpompaa yksinkertaisesti lisätä rajoituskohdat kiinnostavaan inserttiin PCR:n avulla. Tämä tapahtuu monistamalla insertin sekvenssi PCR:llä käyttäen alukkeita, jotka sisältävät tarvittavat restriktiokohdat. Toimivien restriktiokohtien on oltava tietyn emäsmäärän päässä käytettyjen alukkeiden päistä. Vaihtoehtoisesti voit ligatoida erillisestä vektorista peräisin olevan moninkertaisen kloonauskohdan (multiple cloning site, MCS) lentiviraalivektorin yhteen kohtaan ja luoda enemmän käyttökelpoisia restriktiokohtia.

Lisätietoja MCS:n kloonaamisesta ja vaihtamisesta on Addgenen Plasmid Reference and Protocol Guide -julkaisussa.

Miten kloonaan inserttini siirtovektoriin, jossa ei ole käyttökelpoisia restriktiokohtia mutta joka on yhteensopiva Gateway®-kloonausjärjestelmän kanssa?

Gateway®-yhteensopivat vektorit käyttävät rekombinaatiota tuottaakseen kiinnostavan insertin sisältäviä klooneja. Lyhyesti sanottuna insertti kloonataan ensin sisääntulovektoriin alueelle, jota reunustavat sekvenssit (attP1 ja attP2), jotka mahdollistavat insertin rekombinoitumisen kohdevektorin kanssa (tässä tapauksessa kohdevektori olisi lentiviruksen siirtovektori). Määrävektori sisältää attB-sekvenssejä, joiden kanssa attP-sekvenssit yhdistyvät. Lisätietoja Gateway®-kloonausjärjestelmästä saat Invitrogenin verkkosivuilta.

Mitkä turvallisuusongelmat liittyvät lentivirusvektoreiden käyttöön?

Kuten NIH toteaa, kaksi tärkeintä turvallisuusongelmaa, jotka liittyvät lentivirusvektoreiden käyttöön, ovat:

1. Potentiaalinen replikaatiokompetentin lentiviruksen syntyminen
2. Potentiaalinen onkogeneesi

Potentiaaliseen replikaatiokompetentin lentiviruksen syntymiseen puututaan vektoreiden suunnittelulla ja turvallisilla laboratoriokäytännöillä. Vektorien suunnittelun osalta Addgenen tarjoamissa 2. ja 3. sukupolven lentivirusjärjestelmissä viruksen siirto-, kuori- ja pakkauskomponentit erotetaan toisistaan eri vektoreihin. Siirtovektori koodaa haluttua geeniä ja sisältää sekvenssit, jotka integroituvat isäntäsolun genomiin, mutta se ei pysty tuottamaan toimivia viruspartikkeleita ilman kuori- ja pakkausvektoreissa koodattuja geenejä. Ellei pakkaus-, kuori- ja siirtovektoreiden välillä tapahdu rekombinaatiota ja ellei tuloksena syntyvää konstruktiota pakata viruspartikkeliksi, näissä järjestelmissä normaalisti tuotetut virukset eivät pysty replikoitumaan ja tuottamaan lisää virusta ensimmäisen infektion jälkeen. Tältä osin kolmannen sukupolven järjestelmiä pidetään turvallisempina kuin toisen sukupolven järjestelmiä, koska pakkausvektori on jaettu kahteen erilliseen plasmidiin (jolloin järjestelmässä on yhteensä neljä plasmidia). Lisäksi kolmannen sukupolven järjestelmissä ei käytetä HIV-proteiinia tat, jotta siirtovektorista voidaan tuottaa täyspitkä virus virustuotantovaiheessa.

Monet Addgeneen talletetuista lentiviraalisista siirtovektoreista ovat itseinaktivoituvia (SIN) vektoreita. Näissä vektoreissa on deletio viruksen genomin 3’LTR:ssä, joka siirtyy 5’LTR:ään yhden käänteisen transkriptiokierroksen jälkeen. Tämä deleetio lopettaa täyspitkän viruksen transkription sen jälkeen, kun se on integroitunut isäntäsoluun.

Mahdollinen onkogeneesi perustuu suurelta osin lentiviraalisen siirtovektorin sisältämään erityiseen inserttiin (riippuen siitä, onko se onkogeeni vai ei), ja sitä olisi harkittava tapauskohtaisesti.

Bioturvallisuutta olisi aina harkittava suoritettavien kokeiden tarkan luonteen osalta, ja bioturvallisuudesta vastaava toimistosi voi antaa lisätietoja laitoksesi parhaista käytännöistä lentivirustutkimuksen osalta. NIH:llä on lisätietoja lentivirusten turvallisuuteen liittyvistä näkökohdista.