Kasvimateriaali

Lehdet, jotka ovat peräisin lajikkeesta nimeltä The leaves of Strychnos spinosa Lam. kerättiin tammikuussa 2013 Sakaran kylästä, Zariasta, Nigeriasta. Kasvimateriaalin tunnisti kasvitieteilijä Musa Muhammad biologisten tieteiden laitoksen (Ahmadu Bello University, Zaria) herbaario-osastosta, jonne oli talletettu tositelehti (nro 900161). Kerätyt lehdet kuivattiin tuuletetussa huoneessa ilman epäpuhtauksia, minkä jälkeen ne jauhettiin jauheeksi Macsalab-myllyllä (Model 2000 LAB Eriez), säilytettiin lasiastiassa ja säilytettiin pimeässä huoneenlämmössä (25 ± 3 °C) ennen käyttöä.

Uuttaminen ja neste-neste-fraktiointi

Asetoni-, metanoli- ja dikloorimetaani/metanoliuutot

Eri lehtiuutteissa esiintyvien komponenttien fraktioimiseen käytettiin Suffness & Dourosin menetelmän variaatiota. Kuivattu lehtijauhe (2 kg) maseroitiin kolme kertaa asetonissa (6 l), jolloin saatiin asetoniuute (AcetE, 75 g) suodatuksen ja liuottimen poistamisen jälkeen tyhjiössä. Jäämät maseroitiin edelleen metanolissa (6 l) noudattaen samaa menettelyä kuin edellä asetoniuuton yhteydessä, jolloin saatiin metanoliuutetta (MetE, 119,2 g). Osa kuivatuista jauhetuista lehdistä (1 kg) uutettiin myös kolmesti dikloorimetaanin ja metanolin seoksella (1/1, v/v) (3 l), jolloin saatiin dikloorimetaani/metanoliuute (DcmMetE, 114 g) suodatuksen ja liuottimen tyhjiössä poistamisen jälkeen. Osa asetoniuutteesta (70 g) liuotettiin ja fraktioitiin kloroformin ja veden seokseen (1/1, v/v), jolloin saatiin vesi- ja kloroformifraktiot. n-butanolia lisättiin vesifraktioon, jolloin saatiin n-butanoli- (nButF, 25,1 g) ja vesifraktio (Wat1, 5 g). Kloroformifraktio konsentroitiin kuivaksi ja liuotettiin 10-prosenttiseen veteen metanoliin ennen uuttamista heksaanilla. Näin ollen saatiin heksaanifraktio (HexF, 23,9 g) ja jäännös 10 % vettä metanolissa n-heksaanin lisäämisen jälkeen. Veden osuutta metanolissa lisättiin, jotta saatiin 35 % vettä metanolissa -komponentti, josta lopulta saatiin kloroformijakeet (ChlF, 7,05 g) ja 35 % vettä (wat2, 2,8 g) kloroformin lisäämisen jälkeen. Vertailevan TLC:n perusteella vesi (Wat1) ja 35 % vesi metanolissa (Wat2) -fraktiot yhdistettiin yhdeksi fraktioksi (WatF, 7,8 g).

Alkaloidien uuttaminen

Lehtien S. spinosa (1 kg) maseroitiin EtOAc-EtOH-NH4OH seoksella (96:3:1, v/v) (600 ml) ja sitten perkolioitiin EtOAc:lla, jolloin saatiin uutetta (26 g) sen jälkeen, kun liuotin oli poistettu pyöröhaihduttimella alennetussa paineessa. Uutetta liuotettiin EtOAc:hen ja uutettiin 4 % etikkahapolla, jolloin saatiin EtOAc-fraktio (EtAcF, 20,02 g). Hapan liuos (pH 3-4) emäksytettiin Na2CO3:lla pH-arvoon (8-9) ja uutettiin kolme kertaa DCM:llä, jolloin saatiin raakaa alkaloidiuutetta (AlkE, 2,8 g) liuottimen poistamisen jälkeen tyhjiössä.

Antimikrobinen määritys

Mikro-organismit ja inokulumin valmistus

Mikro-organismeina käytettiin kolmea grampositiivista bakteeria, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) ja Enterococcus faecalis (ATCC 29212), ja yhtä gramnegatiivista bakteeria, Escherichia coli (ATCC 25922); ja neljä sientä, mukaan lukien kolme hiivaa Candida albicans, Cryptococcus neoformans (eläinperäiset isolaatit) ja Candida albicans (ATCC 10231) sekä yksi sädesieni Aspergillus fumigatus. Jotkin käytetyistä sienikannoista viljeltiin eläinten kliinisistä sieni-infektiotapauksista ennen hoitoa eläinlääketieteellisen tiedekunnan eläinlääketieteellisten trooppisten sairauksien osastolla. C. albicans eristettiin gouldiansuomusta, C. neoformans gepardista, kun taas A. fumigatus eristettiin kanasta, joka kärsi systeemisestä mykoosista.

Bakteeri- ja sieniviljelmät otettiin 24 tuntia tuoreilta agar-viljelylevyiltä ja inokuloitiin tuoreeseen Sabouraud-dekstroosiliemeen (SDB) sienten osalta ja Mueller-Hinton-liemeen (MHB) (Fluka, Sveitsi) bakteereiden osalta ennen määrityksen suorittamista. Mikrobisuspension sameus säädettiin McFarlandin standardiin 0,5, joka vastaa bakteerien osalta 1-5 × 108 ja sienten osalta 1-5 × 107 cfu/ml:n pitoisuutta. Mikrobisuspensiot laimennettiin edelleen (1:100) väliaineessa, jotta saatiin lopullinen inokulaatio, joka oli noin 1,5 × 106 cfu/ml bakteerien osalta ja 1,5 × 105 cfu/ml sienten osalta.

Minimi-inhibitiokonsentraation määrittäminen

Kaksinkertaista sarjamikrolaimennusmenetelmää, jossa mikrobikasvun indikaattorina käytettiin tetratsoliumviolettia, käytettiin määrittämään uutteiden ja fraktioiden minimi-inhibitiokonsentraatio (MIC) -arvot bakteereja ja sieniä vastaan Masoko et al. mukaan. .

100 μl (10 mg/ml) dimetyylisulfoksidiin (DMSO) liuotettuja uutteita ja fraktioita laimennettiin sarjaan kaksi kertaa steriilillä tislatulla vedellä 96-kuoppaisille mikrotitterilevyille, ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 μl tuoretta mikrobiviljelmää MHB:ssä tai SDB:ssä. DMSO:ta (5 %) käytettiin negatiivisena kontrollina, kun taas (1 mg/ml) gentamysiini ja amfoterisiini B olivat positiivisia kontrolleja. Mikrotitterilevyt suljettiin muovipusseihin ja inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa. Tämän jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 40 μl 0,2 mg/ml p-jodonitrotetratsoliumviolettia (INT) ja mikrotiitterilevyjä inkuboitiin edelleen 37 °C:ssa. Pienimmät inhiboiva pitoisuudet määritettiin 1 ja 2 tunnin kuluttua bakteerien osalta ja 16 ja 36 tunnin kuluttua sienten osalta. MIC määritettiin pienimmäksi pitoisuudeksi, joka esti mikrobikasvun, mikä näkyi formasaanin punaisen värin voimakkuuden vähenemisenä.

Antioksidanttikokeet

Urteista ja fraktioista saatujen uutteiden ja fraktioiden antioksidanttinen aktiivisuus S. spinosan lehdistä määritettiin vapaiden radikaalien sieppauskyky käyttäen 2,2′-difenyyli-1-pikryhydrazyyliä (DPPH) ja 2,2-atsino-bis (3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) diammoniumsuolaa (ABTS).

DPPH-määritys

Antioksidanttinen aktiivisuus suoritettiin Du Toit et al. kuvaamalla tavalla pienin muutoksin. Näytteet liuotettiin HPLC-luokan metanoliin (Sigma-Aldrich, Saksa) ja laimennettiin kaksi kertaa sarjaan pitoisuusalueille 1000-7,81 μg/ml uutteille ja fraktioille ja 40-0,31 μg/ml vakioreferenssille L-askorbiinihapolle (Sigma, Saksa). Lyhyesti sanottuna 40 μl (10 mg/ml) näytteitä annosteltiin 96-kuoppaisiin mikrotitriinilevyihin (Bioster, Espanja) ja laimennettiin metanolilla kaksinkertaisesti sarjaan. Tämän jälkeen 160 μl (3,7 mg/100 ml) metanolista 2,2-difenyyli-1-pikryhydrazyylin (DPPH) liuosta annosteltiin kuhunkin kuoppaan, ja 30 minuutin inkuboinnin jälkeen huoneenlämmössä pimeässä absorbanssi mitattiin 517 nm:ssä Multi-Mode Microplate Reader -laitteella (BioTek, Yhdysvallat). Kunkin näytteen ja vertailustandardin vapaita radikaaleja säästävä aktiivisuus määritettiin estoprosenttina, joka saatiin seuraavalla kaavalla:

Absample on uutteen absorbanssi DPPH:n kanssa, Abblank on uutteen absorbanssi ilman DPPH:ta ja Abcontrol on metanolin ja DPPH:n absorbanssi. Näytteiden pitoisuus, joka vähentää 50 prosenttia vapaiden radikaalien DPPH:ta (IC50), määritettiin kuvaamalla inhibitioprosentti näytekonsentraatioita vastaan. Koe toistettiin kolme kertaa ja tulokset ilmaistaan keskiarvona ± standardipoikkeama.

ABTS-määritys

Urteista ja fraktioista määritettiin ABTS-radikaalin-poistokyky käyttäen Re et al. menetelmää pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna ABTS-radikaali tuotettiin reagoimalla 7 mM ABTS-liuosta ja 2,45 mM kaliumpersulfaattiliuosta huoneenlämmössä 12 tunnin ajan. ABTS-radikaalin kantaliuoksen absorbanssi säädettiin 7,00 ± 0,02:een 734 nm:ssä ennen käyttöä. 40 μl HPLC-luokan metanoliin (Sigma-Aldrich, Saksa) liuotettua uutteiden tai fraktioiden liuosta annosteltiin mikrotitterilevyille ja laimennettiin vetokertaisesti sarjaan pitoisuuksiin 15,62 ja 2000 μg/ml. Troloxia (Sigma, Saksa) ja L-askorbiinihappoa (Sigma, Saksa) valmistettiin pitoisuuksina 200-1,56 μg/ml. Tämän jälkeen 160 μl ABTS-liuosta lisättiin kuoppiin (tyhjää lukuun ottamatta) ja absorbanssi mitattiin 734 nm:ssä 6 minuutin inkuboinnin jälkeen huoneenlämmössä. Troloxia ja askorbiinihappoa käytettiin positiivisina kontrolleina, metanolia negatiivisena kontrollina ja uutteita tai fraktioita ilman ABTS:ää nollakokeena. ABTS-+ -inhibitioprosentti ja IC50-arvo laskettiin kuten edellä on raportoitu DPPH-määritykselle.

Sytotoksisuusmääritys

Asetoniuutteiden ja -fraktioiden sytotoksisuutta Vero-apinan munuaissoluja vastaan arvioitiin MTT:n pelkistämismäärityksellä, kuten aiemmin on kuvattu pienin muutoksin. Solut kylvettiin tiheydellä 1 × 105 solua/ml (100 μl) 96-kuoppaisiin mikrotitterilevyihin ja inkuboitiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa kostutetussa ympäristössä. 24 tunnin inkubaation jälkeen soluja sisältäviin kuoppiin lisättiin näytteitä (100 μl) eri loppupitoisuuksina. Positiivisena referenssinä käytettiin doksorubisiinia. Mukana oli myös sopiva nollakontrolli, jossa oli vastaavat pitoisuudet asetonia, ja levyjä inkuboitiin edelleen 48 tuntia CO2-inkubaattorissa. Tämän jälkeen kunkin kuopan väliaine imettiin soluista, jotka pestiin PBS:llä, ja lopuksi kuhunkin kuoppaan lisättiin uutta väliaineita (200 μl). Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 30 μl MTT:tä (5 mg/ml PBS:ssä) ja levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 4 tuntia. Medium imettiin kuopista ja lisättiin DMSO:ta muodostuneiden formazaanikiteiden liuottamiseksi. Absorbanssi mitattiin BioTek Synergy -mikrolevylukijalla 570 nm:ssä. Kunkin uutteen solukasvun esto ilmaistiin LC50-arvona, joka määriteltiin pitoisuutena, joka aiheutti 50 prosentin eston solujen elinkelpoisuudelle. Selektiivisyysindeksin (SI) arvot laskettiin jakamalla sytotoksiset LC50-arvot MIC-arvoilla (SI = LC50/MIC). Kokeet tehtiin nelinkertaisina ja jokainen koe toistettiin kolmesti.

Statistinen analyysi

Kaikki kokeet tehtiin kolminkertaisina ja arvot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta. Arvojen väliset erot arvioitiin merkitseviksi varianssianalyysin avulla ja tuloksia verrattiin Fisherin pienimmän merkitsevän eron (LSD) avulla 5 %:n merkitsevyystasolla.