Tulokset ja keskustelu

Kaspaasi-3:lla ja kaspaasi-7:llä on erilainen aktiivisuus synteettisiä substraatteja kohtaan.

Kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 aktivoituvat molemmat yleismaailmallisesti apoptoosin aikana riippumatta kuoleman käynnistävästä spesifisestä ärsykkeestä, ja molempien proteaasien katsotaan yleisesti koordinoivan apoptoosin purkuvaihetta pilkkomalla monenlaisia proteiinisubstraatteja (1, 2). Näiden proteaasien suhteellinen osuus solujen tuhoutumisessa on kuitenkin edelleen pitkälti spekulatiivinen. Kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 ovat läheisimmin sukua toisilleen verrattuna muihin nisäkkäiden kaspaaseihin, mutta niillä on kuitenkin huomattavia sekvenssieroja, sillä niiden sekvenssi-identiteetti on 56 prosenttia ja sekvenssin samankaltaisuus 73 prosenttia (kuva 1A). Tutkiaksemme näiden kaspaasien substraattipreferenssejä tarkemmin ekspressoimme molemmat entsyymit His-merkittyinä proteiineina bakteereissa ja puhdistimme ne homogeenisiksi (kuva 1B). Molemmat kaspaasit titrattiin aktiivisen paikan suhteen DEVD-AFC:tä vastaan yhdessä polykasaasi-inhibiittorin zVAD-fmk:n kanssa (kuva 1C). Aktiivipaikan titraustietojen perusteella kunkin entsyymin aktiivinen konsentraatio normalisoitiin, jotta näitä entsyymejä voitiin verrata suoraan toisiinsa myöhemmissä kokeissa (kuva 1D). Tämän jälkeen verrattiin näiden kaspaasien kykyä hydrolysoida synteettisiä tetrapeptidisubstraatteja. Kuten kuvasta 1E käy ilmi, molemmat kaspaasit pilkkovat DEVD-AFC:tä pääasiassa samalla tehokkuudella. Sitä vastoin kaspaasi-3 pilkkoi LEHD-AFC:tä tehokkaammin kuin kaspaasi-7, mikä viittaa siihen, että näillä proteaaseilla on erilainen aktiivisuus tiettyjä synteettisiä substraatteja kohtaan (kuva 1E).