Preguntas frecuentes (FAQ) sobre los plásmidos lentivirales

¿Cuál es la diferencia entre los sistemas lentivirales de 2ª generación y los de 3ª generación?

Para una descripción completa de los lentivirios de 2ª y 3ª generación, por favor revise 2ª vs 3ª generación arriba. En resumen, los sistemas lentivirales de 2ª generación utilizan más proteínas del VIH (en menos plásmidos) para producir partículas lentivirales funcionales que los sistemas de 3ª generación.

• Sistemas de empaquetamiento de 2ª generación: expresan los genes gag, pol, rev y tat del VIH en un único plásmido de empaquetamiento, como psPAX2.
• Sistemas de empaquetamiento de 3ª generación: expresan gag y pol en un plásmido de empaquetamiento y rev en otro, como pMDLg/pRRE y pRSV-Rev. Los sistemas de empaquetamiento de 3ª generación NO expresan tat. Los sistemas lentivirales de tercera generación se consideran más seguros que los de segunda generación, pero pueden ser más difíciles de utilizar porque requieren la transfección con cuatro plásmidos distintos para crear partículas lentivirales funcionales.

IMPORTANTE : Un plásmido de transferencia de tercera generación puede utilizarse con un sistema de empaquetamiento de segunda generación, pero un plásmido de transferencia de segunda generación no puede utilizarse con un sistema de empaquetamiento de tercera generación.

¿Cuál es la diferencia entre un lentivirus y un retrovirus?

Los lentivirus son un subtipo de retrovirus. Desde un punto de vista experimental, la principal diferencia entre los lentivirus y los retrovirus estándar (γ-retrovirus) es que los lentivirus son capaces de infectar tipos de células que no se dividen y que se dividen activamente, mientras que los retrovirus estándar sólo pueden infectar tipos de células mitóticamente activas. Esto significa que los lentivirus pueden infectar una mayor variedad de tipos celulares que los retrovirus.

Tanto los lentivirus como los retrovirus estándar utilizan los genes gag, pol y env para el empaquetamiento; sin embargo, son virus diferentes y, por tanto, utilizan isoformas ligeramente diferentes de estos componentes de empaquetamiento. Por lo tanto, los lentivirus pueden no ser empaquetados eficazmente por los sistemas de empaquetamiento retroviral, y viceversa.

¿Qué cepa bacteriana debería utilizarse para clonar y producir mis plásmidos lentivirales?

Debido a las largas repeticiones terminales que se encuentran en los plásmidos lentivirales, recomendamos utilizar una cepa que reduzca la frecuencia de recombinación homóloga de las regiones inestables, como las células Invitrogen Stbl3™ o NEB Stable. Esto asegurará que las repeticiones se mantengan y a menudo resulta en un mayor rendimiento de ADN. Sin embargo, si el plásmido contiene un casete Gateway que contiene el gen ccdB, es necesaria una cepa de supervivencia ccdB.

¿Qué línea celular debe utilizarse para producir lentivirus?

Para producir lentivirus se suelen utilizar células 293T. La línea celular 293T puede obtenerse en GenHunter.

¿Qué dicta el alcance de la célula huésped lentiviral (tropismo)?

El tropismo lentiviral está determinado por la capacidad de la proteína de la envoltura viral para interactuar con los receptores de la superficie de la célula huésped. La proteína de la envoltura del VSV-G se utiliza habitualmente en la producción de partículas lentivirales porque confiere un amplio tropismo a una serie de especies y tipos celulares. Para más información, véase el artículo de Cronin, et al. sobre las diferentes envolturas y su tropismo.

¿Cómo pueden utilizarse los lentivirus para crear líneas celulares estables?

Los lentivirus pueden utilizarse para crear líneas celulares estables de la misma manera que los retrovirus estándar. Es decir, muchos genomas lentivirales tienen marcadores seleccionables, como el gen de resistencia a la puromicina, que confieren resistencia a los antibióticos a las células huésped infectadas. Cuando estos antibióticos se añaden al medio de crecimiento de las células huésped, eliminan cualquier célula que no haya incorporado el genoma lentiviral y aquellas células que sobreviven pueden expandirse para crear líneas celulares estables, que han incorporado el genoma lentiviral y albergan la información genética codificada por dicho genoma.

Muchos plásmidos de transferencia lentiviral no tienen marcadores seleccionables que confieran resistencia a un antibiótico, pero codifican otro marcador, como la GFP. Un investigador puede utilizar FACS para clasificar las células que expresan GFP y posteriormente expandir estas células en una línea celular.

¿Dónde se integran los lentivirus?

Los estudios de integración viral en todo el genoma han demostrado que los lentivirus se integran con mayor frecuencia en los genes transcritos activamente, y que esta preferencia se conserva en todas las especies objetivo. Aunque la disponibilidad de la cromatina facilita la integración, no explica la preferencia de los lentivirus por los genes transcritos. Los estudios que comparan el lentivirus VIH y el retrovirus MMLV indican que la integrasa viral desempeña un papel en la configuración de las preferencias del sitio de integración. Un determinante celular importante es LEDGF/p75, una proteína de unión lentiviral que recluta el complejo de pre-integración a las unidades transcripcionales y facilita la integración. Los sitios de unión de LEDGF/p75 están enriquecidos en los cuerpos de los genes y mayormente ausentes en los promotores y las regiones intergénicas, reflejando los patrones de integración lentiviral.

¿Pueden utilizarse los plásmidos lentivirales en transfecciones directas en lugar de fabricar virus?

Algunos (pero no todos) los plásmidos de transferencia lentiviral pueden utilizarse en transfecciones transitorias para lograr la expresión del transgén, y los que pueden son principalmente construcciones de tercera generación. Los plásmidos de transferencia lentiviral no están diseñados específicamente para las transfecciones transitorias. Por lo tanto, puede haber una expresión limitada del transgén debido a los LTR lentivirales. Aunque es posible, no se recomienda explícitamente el uso de plásmidos de transferencia lentivirales para transfecciones simples.

¿Es factible expresar ADNc a partir de un plasmido de transferencia lentiviral normalmente utilizado para la expresión de ARNhc?

Sí, es factible, pero primero hay que modificar el promotor dentro del plasmido de transferencia. La mayoría de los plásmidos lentivirales que expresan ARNhc, como el pLKO.1, utilizan un promotor U6 o H1 para dirigir la transcripción de los ARNhc. La expresión del ARNc requiere la ARN pol II y, por lo tanto, un promotor de ARN pol II, como el CMV o el RSV.

¿Qué técnicas se pueden utilizar para clonar un inserto en un plásmido lentiviral que contiene un solo sitio de restricción?

Si un plásmido de transferencia lentiviral contiene un solo sitio de restricción, se pueden utilizar técnicas de clonación estándar para ligar el inserto en este sitio. Si no es posible digerir y clonar inmediatamente el inserto de un vector principal, algunos enfoques posibles para utilizar este sitio incluyen la subclonación o la adición de sitios de restricción compatibles en el inserto de interés utilizando la PCR. El proceso de subclonación consiste en digerir el inserto de interés de su vector principal y ligarlo a un segundo vector de tal manera que el inserto pueda ser digerido posteriormente de este nuevo vector y clonado en el vector lentiviral. Básicamente, se trata de cambiar los sitios de restricción entre los vectores hasta que el gen de interés esté flanqueado por sitios compatibles con los del vector en el que finalmente se quiere ligar el inserto. A menudo es más fácil y lleva menos tiempo añadir sitios de restricción en el inserto de interés utilizando la PCR. Esto se consigue amplificando por PCR la secuencia del inserto utilizando cebadores que contienen los sitios de restricción necesarios. Los sitios de restricción funcionales deben estar a un cierto número de bases de los extremos de los cebadores utilizados. Alternativamente, se podría ligar un sitio de clonación múltiple (MCS) de un vector separado en el sitio único del vector lentiviral y generar más sitios de restricción útiles.

Para obtener más información sobre la clonación y el cambio de un MCS, visite la Guía de referencia y protocolo de plásmidos de Addgene.

¿Cómo clono mi inserto en un vector de transferencia sin sitios de restricción viables pero compatible con el sistema de clonación Gateway®?

Los vectores compatibles con Gateway® utilizan la recombinación para generar clones que contienen el inserto de interés. En resumen, el inserto se clona primero en un vector de entrada en una región flanqueada por secuencias (llamadas attP1 y attP2) que permiten que el inserto se recombine con el vector de destino (en este caso el vector de destino sería el vector de transferencia lentiviral). El vector de destino contiene secuencias attB con las que se recombinan las secuencias attP. Visite el sitio web de Invitrogen para obtener más información sobre el sistema de clonación Gateway®.

¿Qué preocupaciones de seguridad rodean el uso de vectores lentivirales?

Tal y como señalan los NIH, las dos principales preocupaciones de seguridad que rodean el uso de lentivirales son:

1. El potencial de generación de lentivirus competentes para la replicación
2. El potencial de oncogénesis

El potencial de generación de lentivirus competentes para la replicación se aborda mediante el diseño de los vectores y la práctica segura de laboratorio. En cuanto al diseño del vector, los sistemas lentivirales de 2ª y 3ª generación proporcionados por Addgene separan los componentes de transferencia, envoltura y empaquetamiento del virus en vectores diferentes. El vector de transferencia codifica el gen de interés y contiene las secuencias que se incorporarán al genoma de la célula huésped, pero no puede producir partículas virales funcionales sin los genes codificados en los vectores de envoltura y embalaje. A menos que se produzca una recombinación entre los vectores de empaquetado, envoltura y transferencia, y la construcción resultante se empaquete en una partícula viral, no es posible que los virus producidos normalmente a partir de estos sistemas se repliquen y produzcan más virus después de la infección inicial. En este sentido, los sistemas de 3ª generación se consideran más seguros que los de 2ª generación porque el vector de empaquetamiento se ha dividido en dos plásmidos separados (dando lugar a un sistema de cuatro plásmidos en total). Además, los sistemas de 3ª generación no utilizan la proteína tat del VIH para producir virus de longitud completa a partir del vector de transferencia durante la etapa de producción viral.

Muchos de los vectores de transferencia lentivirales que se han depositado en Addgene son vectores autoinactivables (SIN). Estos vectores tienen una deleción en la 3’LTR del genoma viral que se transfiere a la 5’LTR después de una ronda de transcripción inversa. Esta deleción suprime la transcripción del virus completo después de que se haya incorporado a una célula huésped.

El potencial de oncogénesis se basa en gran medida en el inserto específico contenido en el vector de transferencia lentiviral (dependiendo de si es o no un oncogén) y debe considerarse caso por caso.

La bioseguridad siempre debe ser considerada con respecto a la naturaleza precisa de los experimentos que se realizan, y su oficina de bioseguridad puede proporcionar más información sobre las mejores prácticas de su institución con respecto a la investigación lentiviral. El NIH tiene información adicional sobre las consideraciones de seguridad de los lentivirales.