Frequently Asked Questions (FAQ) about Lentiviral Plasmids

Hvad er forskellen mellem 2. generation og 3. generation af lentivirale systemer?

For en fuldstændig beskrivelse af 2. og 3. generation af lentivirusser, se venligst 2. vs. 3. generation ovenfor. Kort fortalt anvender 2. generations lentivirale systemer flere HIV-proteiner (på færre plasmider) for at producere funktionelle lentivirale partikler end 3. generations systemer.

• 2. generations pakningssystemer: udtrykker hiv’s gag-, pol-, rev- og tat-gener alle fra et enkelt pakningsplasmid, f.eks. psPAX2.
• 3. generations pakningssystemer: udtrykker gag og pol fra et pakningsplasmid og rev fra et andet, f.eks. pMDLg/pRRE og pRSV-Rev. 3. generations pakningssystemer udtrykker IKKE tat. Tredje generations lentivirale systemer anses for at være mere sikre end anden generations systemer, men kan være vanskeligere at anvende, fordi de kræver transfektion med fire separate plasmider for at skabe funktionelle lentivirale partikler.

VIGTIGT : Et 3. generations overførselsplasmid kan anvendes sammen med et 2. generations pakningssystem, men et 2. generations overførselsplasmid kan ikke anvendes sammen med et 3. generations pakningssystem.

Hvad er forskellen mellem en lentivirus og en retrovirus?

Lentivirusser er en undertype af retrovirus. Ud fra et eksperimentelt synspunkt er den væsentligste forskel mellem lentivira og standardretrovirusser (γ-retrovirusser), at lentivira er i stand til at inficere ikke-delende og aktivt delende celletyper, mens standardretrovirusser kun kan inficere mitotisk aktive celletyper. Det betyder, at lentivirusser kan inficere et større udvalg af celletyper end retrovirusser.

Både lentivirusser og standardretrovirusser anvender gag-, pol- og env-generne til pakning; de er imidlertid forskellige vira og anvender derfor lidt forskellige isoformer af disse pakkekomponenter. Derfor er det muligt, at lentivirus ikke pakkes effektivt af retrovirale pakningssystemer og omvendt.

Hvilken bakteriestamme skal bruges til kloning og produktion af mine lentivirale plasmider?

På grund af de lange terminale gentagelser, der findes i lentivirale plasmider, anbefaler vi at bruge en stamme, der reducerer frekvensen af homolog rekombination af ustabile regioner, som f.eks. Invitrogen Stbl3™ eller NEB Stable cells. Dette vil sikre, at gentagelserne vil blive opretholdt, og resulterer ofte i et større udbytte af DNA. Hvis plasmidet imidlertid indeholder en Gateway-kassette, der indeholder ccdB-genet, er det nødvendigt med en ccdB-overlevelsesstamme.

Hvilken cellelinje skal anvendes til fremstilling af lentivirus?

293T-celler anvendes normalt til fremstilling af lentivirus. 293T-cellelinjen kan fås hos GenHunter.

Hvad dikterer lentiviral værtscellers rækkevidde (tropisme)?

Lentiviral tropisme bestemmes af evnen hos det virale hætteprotein til at interagere med receptorer på værtscellens overflade. VSV-G-hindeproteinet anvendes almindeligvis til fremstilling af lentivirale partikelpartikler, fordi det giver en bred tropisme over en række arter og celletyper. For yderligere oplysninger henvises til artiklen af Cronin, et al. om forskellige envelopes og deres tropisme.

Hvordan kan lentivirus bruges til at fremstille stabile cellelinjer?

Lentivirusser kan bruges til at fremstille stabile cellelinjer på samme måde som standard retrovirusser. Det vil sige, at mange lentivirale genomer har selekterbare markører, som f.eks. puromycinresistensgenet, der giver antibiotikaresistens til inficerede værtsceller. Når disse antibiotika tilsættes værtscellernes vækstmedium, dræber de alle celler, der ikke har inkorporeret det lentivirale genom, og de celler, der overlever, kan udvides for at skabe stabile cellelinjer, som har inkorporeret det lentivirale genom og indeholder den genetiske information, der er kodet af dette genom.

Mange lentivirale overførselsplasmider har ikke selekterbare markører, der giver resistens over for et antibiotikum, men koder for en anden markør, f.eks. GFP. En forsker kan bruge FACS til at sortere celler, der udtrykker GFP, og senere udvide disse celler til en cellelinje.

Hvor integrerer lentivirus?

Genombredde undersøgelser af viral integration har vist, at lentivirusser oftest integrerer i aktivt transskriberede gener, og at denne præference er bevaret på tværs af målarter. Selv om kromatintilgængelighed letter integrationen, forklarer det ikke den lentivirale præference for transskriberede gener. Undersøgelser, der sammenligner lentiviruset HIV og retrovirusset MMLV, tyder på, at den virale integrase spiller en rolle i udformningen af præferencerne for integrationssteder. En vigtig cellulær determinant er LEDGF/p75, et lentiviralt tetheringsprotein, som rekrutterer præintegrationskomplekset til transkriptionelle enheder og letter integrationen. LEDGF/p75-bindingssteder er beriget i genlegemer og er for det meste fraværende i promotorer og intergeniske regioner, hvilket afspejler mønstre for lentiviral integration.

Kan lentivirale plasmider anvendes i direkte transfektioner i stedet for at fremstille virus?

Nogle (men ikke alle) lentivirale overførselsplasmider kan anvendes i transiente transfektioner for at opnå ekspression af transgenet, og de, der kan, er primært tredje generationskonstrukter. Lentivirale transferplasmider er ikke specielt designet til transiente transfektioner. Derfor kan der være begrænset transgenekspression på grund af de lentivirale LTR’er. Selv om det er muligt, anbefales det ikke udtrykkeligt at anvende lentivirale transferplasmider til simple transfektioner.

Er det muligt at udtrykke cDNA fra en lentiviral transferplasmid, der normalt anvendes til shRNA-ekspression?

Ja, det er muligt, men først skal promotoren i transferplasmidet modificeres. De fleste lentivirale plasmider med shRNA-ekspression, f.eks. pLKO.1, anvender en U6- eller H1-promotor for at drive RNA pol III-styret transkription af shRNA’er. cDNA-ekspression kræver RNA pol II og kræver derfor en RNA pol II-promotor, f.eks. CMV eller RSV.

Hvilke teknikker kan anvendes til at klone et insert i et lentiviralt plasmid, der kun indeholder ét restriktionssted?

Hvis et lentiviralt overførselsplasmid indeholder et enkelt restriktionssted, kan man anvende standard-kloningsteknikker til at ligere insertet til dette sted. Hvis det ikke umiddelbart er muligt at fordøje og klone indsatsen fra en modervektor, omfatter nogle mulige fremgangsmåder til brug af dette sted subkloning eller tilføjelse af kompatible restriktionssteder til indsatsen af interesse ved hjælp af PCR. Processen med subkloning består i at fordøje det interessante insert fra dets modervektor og ligere det til en anden vektor på en sådan måde, at insertet senere kan fordøjes fra denne nye vektor og klones ind i den lentivirale vektor. Dette er i princippet en ombytning af restriktionssteder mellem vektorerne, indtil det pågældende gen er flankeret af steder, der er kompatible med dem i den vektor, som man i sidste ende ønsker at ligere indsatsen ind i. Ofte er det mindre tidskrævende og nemmere blot at tilføje restriktionssteder på det pågældende insert ved hjælp af PCR. Dette gøres ved at PCR-amplificere insertsekvensen ved hjælp af primere, der indeholder de nødvendige restriktionssteder. De funktionelle restriktionssteder skal være et vist antal baser fra enderne af de anvendte primere. Alternativt kan man ligere et multiple kloningssted (MCS) fra en separat vektor ind i det enkelte sted i den lentivirale vektor og generere flere nyttige restriktionssteder.

Du kan finde flere oplysninger om kloning og ændring af en MCS i Addgens Plasmid Reference and Protocol Guide (Plasmid Reference and Protocol Guide).

Hvordan kloner jeg mit insert i en transfervektor uden levedygtige restriktionssteder, men som er kompatibel med Gateway®-kloningssystemet?

Gateway®-kompatible vektorer anvender rekombination for at generere kloner, der indeholder insertet af interesse. Kort sagt klones indsatsen først ind i en entry-vektor i et område, der er flankeret af sekvenser (kaldet attP1 og attP2), som gør det muligt for indsatsen at rekombinere med destinationsvektoren (i dette tilfælde vil destinationsvektoren være den lentivirale transfervektor). Destinationsvektoren indeholder attB-sekvenser, som attP-sekvenserne rekombinerer med. Besøg Invitrogen’s websted for at få flere oplysninger om Gateway®-kloningssystemet.

Hvilke sikkerhedsmæssige betænkeligheder er der ved brugen af lentivirale vektorer?

Som anført af NIH er de to vigtigste sikkerhedsmæssige betænkeligheder ved brugen af lentivirale vektorer følgende:

1. Potentialet for dannelse af replikationskompetent lentivirus
2. Potentialet for onkogenese

Potentialet for dannelse af replikationskompetent lentivirus er behandlet ved udformningen af vektorerne og ved sikker laboratoriepraksis. Med hensyn til vektordesign adskiller 2. og 3. generations lentivirale systemer, der leveres af Addgene, overførings-, envelope- og pakkekomponenterne af virussen på forskellige vektorer. Overførselsvektoren koder for det pågældende gen og indeholder de sekvenser, der skal inkorporeres i værtscellens genom, men kan ikke producere funktionelle virale partikler uden de gener, der er kodet i kuvert- og pakningsvektorerne. Medmindre der sker rekombination mellem paknings-, kuvert- og overførselsvektorerne, og det resulterende konstrukt pakkes ind i en viral partikel, er det ikke muligt for de virus, der normalt produceres fra disse systemer, at replikere og producere mere virus efter den første infektion. I denne henseende anses 3. generations systemer for at være mere sikre end 2. generations systemer, fordi pakningsvektoren er blevet opdelt i to separate plasmider (hvilket resulterer i et system med i alt fire plasmider). Desuden bruger 3. generationssystemer ikke hiv-proteinet tat til at producere fuld længde virus fra overførselsvektoren i viralproduktionsfasen.

Mange af de lentivirale transfervektorer, der er blevet deponeret hos Addgene, er selvinaktiverende (SIN) vektorer. Disse vektorer har en deletion i 3’LTR-delen af det virale genom, som overføres til 5’LTR-delen efter en omvendt transskription i én runde. Denne deletion ophæver transkriptionen af den fulde viruslængde, efter at den er blevet inkorporeret i en værtscelle.

Potentialet for onkogenese er i høj grad baseret på det specifikke insert, der er indeholdt i den lentivirale overførselsvektor (afhængigt af, om det er et onkogen eller ej), og bør overvejes fra sag til sag.

Biosikkerhed bør altid overvejes med hensyn til den præcise karakter af de eksperimenter, der udføres, og dit kontor for biosikkerhed kan give flere oplysninger om din institutions bedste praksis med hensyn til lentiviral forskning. NIH har yderligere oplysninger om overvejelser om sikkerheden ved lentiviral forskning.