Resultater og diskussion

Caspase-3 og caspase-7 udviser differentiel aktivitet over for syntetiske substrater.

Caspase-3 og caspase-7 aktiveres begge universelt under apoptose, uanset den specifikke dødsinitierende stimulus, og begge proteaser anses generelt for at koordinere nedrivningsfasen af apoptose ved at kløve en bred vifte af proteinsubstrater (1, 2). Det relative bidrag, som disse proteaser yder til den cellulære nedbrydning, er imidlertid stadig i høj grad spekulativt. Caspase-3 og caspase-7 er nærmest beslægtede med hinanden sammenlignet med andre caspaser fra pattedyr, men udviser ikke desto mindre en betydelig sekvensdivergens med en samlet sekvensidentitet på 56 % og en sekvenslighed på 73 % (fig. 1A). For at undersøge substratpræferencerne for disse caspaser mere detaljeret udtrykte vi begge enzymer som His-mærkede proteiner i bakterier og rensede dem til homogenitet (Fig. 1B). Begge caspaser blev aktivt-site-titreret mod DEVD-AFC i kombination med polycaspaseinhibitoren zVAD-fmk (Fig. 1C). På grundlag af data fra titrering af det aktive sted blev den aktive koncentration af hvert enzym normaliseret for at muliggøre direkte sammenligninger mellem disse enzymer i efterfølgende eksperimenter (fig. 1D). Vi sammenlignede derefter disse caspaser med hensyn til deres evne til at hydrolyserer et panel af syntetiske tetrapeptid-substrater. Som det fremgår af fig. 1E, spaltede begge caspaser fortrinsvis DEVD-AFC med stort set identisk effektivitet. I modsætning hertil spaltede caspase-3 LEHD-AFC mere effektivt end caspase-7, hvilket tyder på, at disse proteaser har forskellige aktiviteter over for visse syntetiske substrater (fig. 1E).