ABSTRACT

Před ligací musí být každý Okazakiho fragment syntetizovaný na opožděném vlákně u eukaryot nukleolyticky zpracován. Nukleázové štěpení probíhá v kontextu 5′ lalokových struktur vytvořených prostřednictvím syntézy s posunem vlákna pomocí DNA polymerázy delta. Existují nejméně tři nukleázy DNA: Rad27 (Fen1), Dna2 a Exo1 se podílejí na zpracování Okazakiho fragmentů. Podíl jednotlivých nukleáz na syntéze zpožděného vlákna ani struktura meziproduktů DNA vznikajících v jejich nepřítomnosti však nebyly in vivo jasně definovány. Podmíněným vyřazením nukleáz z opožděného řetězce a přímou analýzou Okazakiho fragmentů syntetizovaných in vivo v S. cerevisiae provádíme systematické hodnocení vlivu Rad27, Dna2 a Exo1 na syntézu opožděného řetězce. Zjistili jsme, že Rad27 zpracovává většinu fragmentů zpožďujícího se řetězce, k čemuž významně přispívá Exo1, ale nikoli Dna2. Pokud je narušeno štěpení nukleázou, pozorujeme snížení syntézy posunutých vláken na rozdíl od rozsáhlého vytváření dlouhých Okazakiho fragmentů 5′, jak předpovídají některé modely. Dále jsme pomocí konstruktů s omezeným buněčným cyklem prokázali, že nukleolytické zpracování i ligace Okazakiho fragmentů mohou být odděleny od replikace DNA a odloženy až po dokončení syntézy většiny genomu

.