PMC
Použití NEBcutter
NEBcutter přijímá vstupní sekvenci, kterou lze vložit, převzít z lokálního souboru nebo získat z NCBI jako soubor GenBank prostřednictvím jejího přístupového čísla. K dispozici jsou různé možnosti výběru velikosti ORF, které se mají zobrazit, a sady restrikčních enzymů, které se mají použít. Program vypočítá pozice všech míst restrikčních enzymů, přičemž si všímá těch, která by mohla být potenciálně blokována překrývající se metylací, a vyhledá ORF v sekvenci. Poté zobrazí schematický diagram sekvence, dlouhé ORF na základě pravidel popsaných v Metodách a všechny restrikční enzymy, které ji řezají právě jednou. V úvodním zobrazení se také zobrazí enzymy, které lze použít při kompletním štěpení k vyříznutí každého zobrazeného ORF. Obrázek Obrázek11 ukazuje typický digest, v tomto případě lineární zobrazení plazmidu pBR322. Pokud je původní sekvence DNA kruhová, nabízí se jak lineární, tak kruhové zobrazení. Od počátečního zobrazení existuje mnoho možností dalšího postupu, včetně vlastního trávení pomocí enzymů podle vašeho výběru a různých zobrazení trávení. Z lineárních zobrazení je také možné zvětšit vybranou oblast sekvence pro podrobnější zobrazení. Jedna z možností umožňuje vybrat určitou oblast a zobrazit ty enzymy, které s ní bezprostředně sousedí. To je užitečné pro vyhledání enzymů schopných vyříznout požadovanou oblast. Pokud zvětšení vede k oblasti <60 nukleotidů, zobrazí se skutečná sekvence (obr. (obr. 2),2) spolu s případným překladem. Na tomto displeji jsou zobrazeny všechny enzymy, které sekvenci stříhají, všechny báze, které tvoří části rozpoznávací sekvence restrikčního enzymu, jsou zvýrazněny a pohybem myši nad názvem enzymu se vytvoří rámeček s rozpoznávací sekvencí, která je zaznamenána, a samotná sekvence se na displeji podtrhne.
Lineární zobrazení digestu plazmidu pBR322. Všimněte si, že dva hlavní ORF jsou lemovány místy (MseI a PflMI; BspHI a EarI), která by mohla být použita k jejich vyříznutí z kompletní sekvence plazmidu. V tomto zobrazení jsou uvedeny pouze enzymy, které štěpí sekvenci jednou. Možnosti dalšího štěpení a zobrazení jsou k dispozici prostřednictvím tlačítek ve spodní části zobrazení.
Zvětšené zobrazení krátké oblasti z pBR322. Všimněte si, že červeně a modře zvýrazněné báze tvoří části rozpoznávacích míst restrikčních enzymů. Červené jsou jednoznačné, zatímco modré jsou degenerované báze. BsiEI tedy rozpoznává sekvenci CGRYCG. Vnější zbytky CG jsou invariantní, zatímco vnitřní báze jsou degenerované a v konkrétní zobrazené sekvenci jsou GT. Černě znázorněné báze nejsou součástí žádného rozpoznávacího místa restrikčního enzymu. Toto zobrazení může být užitečné při hledání restrikčních enzymů schopných rozlišit alely SNP.
Na jakémkoli hlavním zobrazení se po najetí myší na název restrikčního enzymu zobrazí jeho rozpoznávací sekvence a přesné číslo báze, na které štěpí. Pokud je pro enzym přítomno více než jedno místo, pak jsou všechna ostatní místa podtržena. Kliknutím na název enzymu se zobrazí stránka se souhrnem informací o enzymu včetně jeho citlivosti na metylaci, druhů produkovaných konců, dostupných izochizomerů a seznamu dalších enzymů, které mohou produkovat kompatibilní konce. U enzymů NEB jsou uvedeny informace o podmínkách trávení a odkaz na webovou stránku NEB.
Klíčovou vlastností nástroje NEBcutter je, že zahrnuje vše, co je zaznamenáno v databázi REBASE o metylační citlivosti některého ze zobrazených enzymů, pokud se překrývají s místem Dam (GATC), místem Dcm (CCWGG), místem CpG, místem EcoKI (AACN6GTGC) nebo místem EcoBI (TGAN8TGCT). Pokud jsou provedeny teoretické digesce, výsledky zahrnují srovnání účinků metylace se zvýrazněním pásů, které se posouvají (obr. (obr. 33).
Teoretická digesce zobrazující účinky překrývající se metylace Dcm na místa MscI (rozpoznávací sekvence: TGGCCA) přítomná v sekvenci, pokud by bakteriofág lambda byl kultivován v kmeni E.coli exprimujícím metyltransferázu Dcm (rozpoznávací sekvence: CCWGG). Fragmenty, které jsou ovlivněny metylací Dcm, jsou znázorněny červeně. Virtuální gel je založen na interpolaci kubické spline křivky vygenerované z experimentálních dat vytvořených s fragmenty známé velikosti.
Na každé stránce jsou uvedeny horké odkazy, které vedou zpět na hlavní stránku, poskytují pomoc při interpretaci zobrazení nebo umožňují uživatelům zaslat komentáře zpět autorům. Rozhraní bylo navrženo tak, aby bylo co nejintuitivnější a poskytovalo snadný přístup k hlavním funkcím užitečným pro výzkumné pracovníky, kteří se pokoušejí štěpit DNA. Současná verze programu NEBcutter zpracovala více než 400 000 sekvencí od uživatelů. V současné době připravujeme řadu vylepšení programu NEBcutter a vydání verze 2.0 je plánováno na 1. července
.