Ústředním dogmatem molekulární biologie je DNA→RNA→Protein. Aby bylo možné syntetizovat určitý protein, musí být DNA nejprve přepsána do messengerové RNA (mRNA). mRNA pak může být na ribozomu přeložena do polypeptidových řetězců, které tvoří primární strukturu proteinů. Většina proteinů je poté modifikována řadou posttranslačních modifikací, včetně skládání proteinů, tvorby disulfidových můstků, glykosylace a acetylace, aby vznikly funkční a stabilní proteiny. Exprese proteinů se týká druhého kroku tohoto procesu: syntézy proteinů z mRNA a přidání posttranslačních modifikací

Zjistěte více o molekulární biologii v naší elektronické knize Plasmidy 101!

Výzkumníci používají různé techniky k řízení exprese proteinů pro experimentální, biotechnologické a lékařské aplikace. Výzkumníci mohou vizualizovat proteiny in vivo jejich označením fluorescenčními proteiny pro studium lokalizace nebo purifikovat proteiny pro studium jejich struktury, interakcí a funkcí. Proteiny lze také purifikovat pro použití ve výzkumu molekulární biologie (např. polymerázy a další enzymy mohou být purifikovány a použity k manipulaci s DNA) nebo v medicíně (např. inzulín).

Proteiny, na rozdíl od DNA, kterou lze relativně snadno syntetizovat, musí být vyráběny pomocí složitých směsí získaných z buněk nebo za použití živých buněk. Existuje několik typů expresních systémů používaných pro výrobu a čištění proteinů. Patří mezi ně savčí, hmyzí, bakteriální, rostlinné, kvasinkové a bezbuněčné expresní systémy.

Všeobecná strategie exprese proteinů spočívá v transfekci buněk zvolenou šablonou DNA a v tom, že se tyto buňky nechají přepsat, přeložit a modifikovat požadovaný protein. Modifikované proteiny lze poté extrahovat z lyzovaných buněk pomocí proteinových značek a oddělit je od kontaminantů pomocí různých purifikačních metod. Rozhodnutí, který expresní systém použít, závisí na několika faktorech:

1. Protein, který se snažíte exprimovat
2. Kolik proteinu potřebujete
3. Vaše plány pro následné aplikace

V tomto příspěvku na blogu shrneme některé z nejběžnějších expresních systémů včetně jejich výhod a výhrad, které je třeba mít na paměti před výběrem systému.

Samčí expresní systémy

Samčí buňky jsou ideálním systémem pro expresi savčích proteinů, které pro správnou funkci proteinu vyžadují několik posttranslačních modifikací. Většina konstruktů DNA určených pro expresi savců využívá virové promotory (SV40, CMV a RSV) pro robustní expresi po transfekci. Savčí systémy mohou exprimovat proteiny jak přechodně, tak prostřednictvím stabilních buněčných linií. Obě metody poskytují vysoké výtěžky proteinů, pokud je transfekce úspěšná.

Některé savčí systémy také umožňují kontrolovat, kdy je protein exprimován, pomocí konstitutivních a indukovatelných promotorů. Inducibilní promotory jsou velmi užitečné, pokud je požadovaný proteinový produkt ve vysokých koncentracích pro buňky toxický. Navzdory svým výhodám vyžadují savčí expresní systémy ve srovnání s jinými systémy náročné podmínky kultivace buněk.

Hmyzí expresní systémy

Hmyzí buňky lze také použít k produkci komplexních eukaryotických proteinů se správnými posttranslačními modifikacemi. Existují dva typy hmyzích expresních systémů; bakulovirem infikované a nelytické hmyzí buňky.

Bakulovirové expresní systémy jsou velmi výkonné pro expresi rekombinantních proteinů na vysoké úrovni. Tyto systémy umožňují vysokou expresi velmi složitých, glykosylovaných proteinů, které nelze produkovat v buňkách E. coli nebo kvasinkách. Jediným problémem baculovirových systémů je, že infikovaná hostitelská buňka nakonec lyzuje. Lýza buňky zastaví produkci proteinů, ale existují nelytické expresní systémy hmyzích buněk (sf9, Sf21, Hi-5 buňky), které umožňují kontinuální expresi genů integrovaných do genomu hmyzí buňky. Oba tyto typy hmyzích expresních systémů lze zvětšit pro produkci velkého množství bílkovin.

Mezi nevýhody expresních systémů hmyzích buněk patří to, že výroba virů může být poměrně časově náročná a že hmyzí buňky vyžadují náročné kultivační podmínky podobné expresním systémům savců.

Bakteriální expresní systémy

Pokud chceme rychle a levně vyrobit velké množství bílkovin, je téměř vždy řešením bakteriální hostitelská buňka. E. coli je rozhodně jedním z nejoblíbenějších hostitelů pro expresi proteinů s několika kmeny, které jsou specializované na expresi proteinů. Exprese bílkovin v bakteriích je poměrně jednoduchá; DNA kódující požadovanou bílkovinu se vloží do plazmidového expresního vektoru, který se poté transformuje do bakteriální buňky. Transformované buňky se množí, jsou indukovány k produkci požadovaného proteinu a poté lyzovány. Protein lze poté z buněčných zbytků přečistit.

Existuje několik populárních vektorů DNA, které lze použít k produkci velkého množství proteinu v bakteriálních buňkách: například vektory pET, pRSET, Gateway pDEST a pBAD. Exprese proteinu z každého z těchto vektorů je řízena jiným promotorem, což vede k různým úrovním exprese z každého vektoru; nižší exprese může být nutná, pokud je váš protein toxický pro E. coli. Ze všech vektorů poskytuje pET pod kontrolou promotoru T7 lac a indukovaný laktózou nejvyšší úroveň exprese proteinu.

I přes jejich snadné použití je důležité si uvědomit, že bakterie obvykle nemohou produkovat funkční vícedoménové savčí proteiny, protože bakteriální buňky nejsou vybaveny k přidávání příslušných posttranslačních modifikací. Kromě toho se mnoho proteinů produkovaných bakteriemi stává nerozpustnými a tvoří inkluzní tělíska, která se obtížně extrahují bez drsných činidel a trpělivosti.

Rostlinné expresní systémy

Rostliny poskytují levný a technologicky nenáročný způsob hromadné exprese rekombinantních proteinů. Pro expresi proteinů bylo použito mnoho buněk z různých druhů rostlin, jako je kukuřice, tabák, rýže, cukrová třtina, a dokonce i hlízy brambor.

Rostlinné systémy mají mnoho stejných vlastností a požadavků na zpracování jako expresní systémy savčích buněk, včetně většiny komplexních posttranslačních modifikací. Extrakce a purifikace rekombinantních proteinů z rostlin však může být nákladná a časově náročná, protože samotná rostlinná pletiva jsou biochemicky složitá.

Aby vědci tyto problémy obešli, využili přirozené sekrece biochemických látek a proteinů prostřednictvím kořenů rostlin. Označení rekombinantních proteinů přirozeně vylučovaným rostlinným peptidem umožňuje snadnější přístup k požadovanému proteinu a jeho přečištění. Přestože se jedná o poměrně mladou technologii, byly rostlinné buňky použity k expresi široké škály proteinů včetně protilátek a léčiv, konkrétně interleukinů.

Rostlinné expresní systémy

Rostliny jsou skvělým expresním systémem pro tvorbu velkého množství rekombinantních eukaryotických proteinů. Ačkoli lze pro expresi proteinů použít mnoho druhů kvasinek, S. cerevisiae je nejspolehlivějším a nejčastěji používaným druhem díky svému využití jako modelového organismu v genetice a biochemii.

Při použití S. cerevisiae výzkumníci často umisťují rekombinantní proteiny pod kontrolu promotoru indukovaného galaktózou (GAL). Mezi další běžně používané promotory patří promotory PHO5 indukovatelné fosfátem a CUP1 indukovatelné mědí. Kvasinkové buňky se pěstují v dobře definovaných médiích a lze je snadno přizpůsobit fermentaci, což umožňuje rozsáhlou a stabilní produkci proteinů.

Všeobecně se s kvasinkovými expresními systémy pracuje snadněji a levněji než se savčími buňkami a na rozdíl od bakteriálních systémů jsou často schopny modifikovat komplexní proteiny. Kvasinkové buňky však mají pomalejší růst než bakteriální buňky a podmínky pěstování je často třeba optimalizovat. Kvasinkové buňky jsou také známé hyperglykosylací proteinů, což může být problém v závislosti na zvoleném proteinu.

Bezbuněčné expresní systémy

V bezbuněčných expresních systémech se proteiny sestavují in vitro pomocí purifikovaných složek transkripčního a translačního aparátu. Mezi ně patří ribozomy, RNA polymeráza, tRNA, ribonukleotidy a aminokyseliny. Bezbuněčné expresní systémy jsou ideální pro rychlé sestavení více než jednoho proteinu v jedné reakci. Hlavní výhodou těchto systémů je jejich schopnost sestavovat proteiny se značenými nebo modifikovanými aminokyselinami, které jsou užitečné v různých následných aplikacích. Bezbuněčné expresní systémy jsou však drahé a jejich použití je technicky velmi náročné.

Alyssa D. Cecchetelli je vědecká pracovnice ve společnosti Addgene. Doktorát získala na Northeastern University a zajímá se zejména o buněčnou signalizaci a komunikaci. Ráda pomáhá vědecké komunitě sdílet plazmidy.

Další zdroje

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Rekombinantní exprese proteinů v Escherichia coli: pokroky a výzvy
• Produkce rekombinantních proteinů v kořenových exudátech rostlin

.