Generace knockoutovaných myší

Technologie používané k vytváření knockoutovaných myší zahrnují homologní rekombinaci (nebo cílení genů) a genovou past. Oba přístupy zahrnují použití myších embryonálních kmenových buněk (ES), které jsou izolovány z myších embryí přibližně čtyři dny po oplodnění. Při prvním přístupu, homologní rekombinaci, se do jádra myší ES buňky vnese umělá DNA s doprovodnými sekvencemi, které jsou homologní (identické) s těmi, které se vyskytují před a za sekvencí DNA cílového genu. Buňka ES rozpozná homologické doprovodné sekvence a vymění stávající DNA cílového genu za segmenty cizí DNA. Cizí DNA je však neaktivní. Její začlenění do genomu ES buňky tedy inaktivuje nebo vyřadí cílový gen. Cizí DNA je obvykle upravena tak, aby nesla reportérový gen, který označuje nebo značí umístění stávajícího genu a umožňuje výzkumníkům sledovat jeho přítomnost v genomu myší buňky v průběhu její replikace. Homologní rekombinace je metodou volby v případě, že je požadováno, aby byla specifická alela (gen) nahrazena upravenou sekvencí DNA, aniž by byly ovlivněny jiné geny v genomu.

Gen trapping také využívá umělou DNA, která nese reportérový gen. Namísto zaměření na konkrétní gen je však cizí DNA náhodně začleněna do libovolného genu v genomu myších ES buněk. Cizí sekvence zabrání narušenému genu kódovat jeho proteinové produkty, čímž se gen stane neaktivním. Aktivace reportérového genu po začlenění do genomu ES buněk umožňuje výzkumníkům sledovat aktivitu genu a odvodit funkci narušeného genu.

Umělé sekvence DNA se obvykle zavádějí do myších ES buněk pomocí retroviru nebo jiného virového vektoru a modifikované ES buňky se poté pěstují v buněčných kulturách. Po několika dnech jsou buňky vpraveny do raných myších embryí, která jsou následně implantována do dělohy náhradní samice, kde se nakonec vyvíjejí a jsou donošena. Takto narozená myší mláďata obsahují jak modifikovanou, tak nemodifikovanou tkáň, a nejsou tedy úplnými knockoutovanými myšmi. Aby se vytvořil pár skutečných knockoutovaných myší (homologních knockoutů), musí být myši kříženy v několika generacích. Zpočátku jsou zvířata křížená s jinými myšmi, aby vznikli heterozygotní jedinci (myši s jednou kopií cílového genu); heterozygotní zvířata jsou pak křížená, aby vznikli homozygoti.