Genové cílení v embryonálních kmenových buňkách

Postupem genového cílení v ES buňkách lze do zárodečné linie myší vnést potenciálně jakoukoli požadovanou genetickou manipulaci. Specifické genové sekvence mohou být konstitutivně nebo podmíněně odstraněny (Knock-out), specifické mutace nebo změny párů bází mohou být provedeny přesně v rámci zájmového genu a reportérové geny nebo jiné expresní kazety mohou být zavedeny do definovaných míst v genomu (Knock-in). Pomocí této technologie lze vyměnit myší sekvence za lidské sekvence a vytvořit tak humanizované myší modely.

Tato technika může trvat až rok vývoje, takže je nezbytné investovat na začátku projektu značný čas, aby se zajistilo, že pro požadovaný model bude vybrána nejvhodnější technologie a genetická strategie. Transgenní jádro může poskytnout poradenství pro tyto typy rozhodnutí a je nezbytné, aby všechny projekty cílení byly s jádrem podrobně projednány před zahájením práce v laboratoři.

Když je rozhodnuto o strategii, je zkonstruován cílený vektor a je navržena a otestována robustní screeningová strategie, aby se zajistilo, že požadovaná genomická manipulace může být detekována na genomické úrovni. Cílený vektor je poté transfekován do ES buněk a rekombinantní klony jsou podrobeny screeningu na požadovanou homologní rekombinaci. Tyto buňky jsou poté injikovány do preimplantačních embryí a výsledné chimérické myši jsou použity pro šlechtění geneticky modifikované linie myší.

Služba

Nabízí se flexibilní služba, kterou lze rozdělit na konkrétní fáze vývoje modelu v závislosti na dostupných zdrojích.

Zahájení projektu – zdarma

• Konzultace se skupinou při řešení vhodné technologie pro dosažení bezpečného a použitelného modelu
• Průzkum databank genových pastí pro již existující klony ES buněk
• Průzkum zdrojů konsorcia Knock-out pro již existující cílové vektory, klony a modely ES buněk

Konzultace pro konstrukci cílených vektorů – zdarma

• Analýza genomické sekvence za účelem identifikace oblastí, které s vysokou pravděpodobností představují použitelné homologické oblasti pro cílení genů
• Konzultace se skupinou za účelem řešení genetické strategie potřebné k dosažení bezpečného, použitelného modelu
• Konstrukci cíleného vektoru jádro nezajišťuje, ale může pomoci s poskytnutím kazet a metodického poradenství
• Vytvoření screeningové strategie jádro nezajišťuje, ale může pomoci s poskytnutím kazet a metodiky. poradenství

Transfekce cíleného genu v embryonálních kmenových buňkách

• Transfekce dokončeného cíleného vektoru do embryonálních kmenových buněk
• Izolace a skladování nejméně 192 nezávislých rekombinantních buněčných klonů
• Příprava DNA a dodání 96jamkových destiček pro screening
• Rozmrazení, expanze předpokládaných pozitivních klonů
• Další příprava DNA z předpokládaných pozitivních klonů pro potvrzovací screening
• Karyotypová analýza cílových klonů

Blastocystová injekce klonů ES buněk

• Injekce ES buněk do preimplantačních embryí
• Generace a držení chimér po dobu až 3 týdnů.
• Doporučení pro strategii chovu

.