Reagencie pro buněčné kultury

Glycerolová zásoba lidského Akt1 ORF byla získána jako vektor pENTR221 od GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). Modifikovaný cílový vektor (pcDNA/FRT/TO), obsahující SH Tag, byl velkorysým darem od Dr. Matthiase Gstaigera (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Zurich, Švýcarsko). Buňky Flp-In TREx HEK293 (#R780-07), směs enzymů LR Clonase II (#11791-100), vektor pOG44 (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) a Dynabeads Protein A (#100.02D) byly získány od společnosti Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) byl získán od společnosti Roche. DMEM (#12430-054) a RPMI 1640 (#22400-089) byly získány od společnosti GIBCO. Trypsin (#CC5027.010L) byl zakoupen od společnosti Genetics. Normální FBS (#SH30070.03) a Tet screening FBS (#SH30070.03T) byly pořízeny od společnosti Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazol (#M1404-10MG), Propidium Jodid (#P4170-250 mg) a Lys C proteáza (#P3428) byly získány od firmy Sigma. Značky SILAC byly pořízeny od společnosti Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Koktejl inhibitorů proteáz (100X) (#78429) a Pierce anti-HA agarózové kuličky (#26182) byly získány od společnosti Thermo Scientific. Kuličky MagStrep ‚Type 2HC‘ (#2-1612-002) byly získány od společnosti IBA BioTagnology. Společnost Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Indie syntetizovala peptid HA. Nitrocelulózová membrána (#RPN303E) byla zakoupena od společnosti GE Healthcare. Trypsinová proteáza (#4370282) byla pořízena od společnosti AB Sciex. Značka plné molekulové hmotnosti duhových proteinů (#RPN800E) byla od společnosti Amersham. siRNA, Dharmafect Transfection Reagent (#T-2001-03), RNase Free Water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) byly získány od společnosti Dharmacon. RNáza A (#19101) byla od společnosti Qiagen.

Protilátky pro Western Blot

Protilátky použité v této studii byly: anti-HA (#SC-7392; myší monoklonální, ředění 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; myší monoklonální, ředění 1:1000) a anti-GAPDH (#SC-25778; králičí polyklonální, ředění 1:1000) od společnosti Santa Cruz; anti-CDC2 (#77055; králičí polyklonální, ředění 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; králičí polyklonální, ředění 1:1000) od společnosti Santa Cruz:1000) od společnosti Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; králičí monoklonální, ředění 1:10000); anti-API5 (#ab56392; myší monoklonální, ředění 1:1000) a anti-SH3PX1 (#EPR14399; králičí monoklonální, ředění 1:2000) od společnosti Abcam; sekundární protilátky byly pořízeny od společnosti Licor Biosciences-Odyssey kozí anti-myší (#926-32210, ředění 1:15000) a Odyssey kozí anti-králík (#926-32211, ředění 1:15000).

Vytvoření stabilní buněčné linie

V této studii byl k vytvoření expresního konstruktu pomocí LR rekombinační reakce za přítomnosti vhodného cílového vektoru (pcDNA/FRT/TO) použit vstupní vektor Akt1 kompatibilní s bránou (pENTR221). Cílový vektor byl upraven tak, aby obsahoval značku Strep-HA (SH) obsahující peptid vázající streptavidin (Strep) a značku epitopu hemaglutininu (HA). Tato značka SH byla nakonec použita k selektivnímu vyjmutí Akt1 a jeho interagujících partnerů z komplexních buněčných lyzátů. Pro vytvoření indukovatelné buněčné linie pro expresi Akt1 byl expresní konstrukt ko-transfekován s rekombinázou pOG44 do buněk Flp-In TREx HEK293 stabilně exprimujících represor Tet. Transfekce byla usnadněna transfekčním činidlem Xtremegene 9. Buňky exprimující konstrukt Akt1 byly selektovány po dobu 15-20 dnů v médiu RPMI obsahujícím hygromycin-B (75 µg/ml), doplněném 10 % FBS stíněného Tetem. Tyto vybrané buňky byly později sdruženy k expanzi pro pulldown experimenty.

Koncentrace Tet potřebná pro optimální expresi Akt1 byla stanovena indukcí exprese Akt1 v rozmezí koncentrací Tet (0,1 µg/ml až 5 µg/ml) a hladiny exprese proteinu Akt1 byly sledovány v přítomnosti a nepřítomnosti Tet pomocí protilátky anti-Akt1 i anti-HA. Tet byl do kultivačního média doplňován každých 24 hodin, aby byla udržována stabilní exprese Akt.

PDT Experiment

PDT pro buňky HEK293 byl sledován u normálních buněk oproti buňkám s nadměrnou expresí Akt1 po dobu 72 hodin od počátečního podání Tet. Pro každý bod pozorování byla paralelní sada 104 normálních a Akt1-overexprimujících buněk HEK293 nasazena ve třech opakováních na 96jamkovou destičku do 100 µl média DMEM obsahujícího 10% sérum. Tet byl do kultivačního média přidán 24 hodin po výsevu a po dalším inkubačním intervalu 24 hodin byly buňky sklizeny jako čas 0. Poté byla sada buněk v paralelní kultuře sklizena každých 24 hodin až do 72 hodin. PDT byla stanovena počítáním buněk v každém časovém bodě metodou barvení trypanovou modří.

Značkování SILAC pro rozlišení interaktomu Akt1 specifického pro fázi buněčného cyklu

Buňky HEK293 s overexpresí Akt1 byly expandovány a kultivovány v médiu SILAC obsahujícím „lehké“ (K0R0), „střední“ (K6R6) nebo „těžké“ (K8R10) izotopy lysinu (K) a argininu (R) po dobu nejméně 5 zdvojení buněk, aby bylo umožněno úplné začlenění značek. Při 70% konfluenci byl do média přidán Tet (1 µg/ml), aby se indukovala exprese Akt1. Buňky značené K0R0 byly zadrženy ve fázi G0 nočním hladověním, což je široce používaná metoda k zadržení buněk ve fázi G042. Za tímto účelem byla normální kompletní kultivační média nahrazena RPMI bez séra a buňky byly udržovány v kultuře po dobu 16-18 hodin při 37 °C v 5% atmosféře CO2. Buňky označené K8R10 byly zadrženy ve fázi G1/S kultivací buněk přes noc v přítomnosti 5 µg/ml afidikolinu; reverzibilního inhibitoru replikace eukaryotické jaderné DNA43. Podobně byl pro zastavení G2 do kultivačního média buněk značených K6R6 přidán 400ng/ml nocodazolu a inkubace trvala 16-18 hodin před peletováním buněk. Nocodazol narušuje polymerizaci mikrotubulů, čímž dochází k zástavě buněk v G2/M fázi44. Zastavené buňky byly trypsinizovány a počítány odděleně metodou barvení trypanovou modří. Buňky zadržené v různých fázích buněčného cyklu byly poté peletovány centrifugací při 1500 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Pro každou fázi buněčného cyklu bylo vytvořeno více buněčných pelet, které byly až do použití skladovány při -80 °C.

SH-tagged Affinity Purification

Stejný počet Akt1-overexprimujících buněk zadržených ve fázích G0, G1/S a G2 byl smíchán v poměru 1:1:1 a lyzován na ledu po dobu 1 hodiny v IP pufru (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1% NP-40; 1X koktejl inhibitorů proteáz a 1 mM PMSF). Buněčný lyzát byl zbaven zbytků po odstředění při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 °C. Proteinové komplexy Akt1 byly selektivně purifikovány v paralelních sadách současným zaměřením na značku Strep a HA podle pokynů v manuálech příslušných sad. Stručně řečeno, proteinové komplexy Akt1 značené strepem byly smíchány se 100 µl magnetických kuliček streptaktinu a ponechány 1 hodinu v inkubaci na rotační třepačce při 4 °C. Veškeré nespecifické interaktory byly smyty během pěti po sobě jdoucích promývacích kroků pěti objemy promývacího pufru se streptaktinem. Protein Akt1 a jeho interaktory byly nakonec eluovány ve dvou elučních krocích pomocí 125 µl strepactinového elučního pufru na eluci (invitrogen). Pro purifikaci HA značených proteinových komplexů Akt1 byly očištěné buněčné lyzáty inkubovány s 50 µl předem promytých HA agarózových kuliček po dobu 2 hodin při 4 °C na rotační třepačce. Po třech rychlých promytích deseti objemovými dávkami pufru TBS-T byly proteinové komplexy Akt1 třikrát eluovány 50 µl HA peptidu (250 µg/ml). Výše uvedené purifikační kroky byly provedeny pro tři takové biologické replikáty k purifikaci proteinu Akt1 a jeho interakčních partnerů a eluáty Strep a HA pro každý replikát byly spojeny, lyofilizovány a uloženy při -80 °C až do dalšího zpracování.

Destrukce proteinu a příprava vzorku pro LC-MS/MS

Všechny tři biologické replikáty byly zpracovány pro destrukci proteinu samostatně. K lyofilizovanému vzorku bylo přidáno 40 µl 100 mM hydrogenuhličitanu amonného, dobře se vortexovalo a následně byly přidány 2 µl denaturačního pufru (AB Sciex). Vzorky byly redukovány 4 µl redukčního činidla (AB Sciex) po dobu 1 hodiny při 60 °C. Byly přidány 2 µl blokovacího činidla pro cystein po dobu 10 minut při pokojové teplotě, aby se zablokovaly redukované zbytky cysteinu. Štěpení proteinů bylo zahájeno přidáním 5 µl 0,1 µg/µl endoproteinázy Lys C. Vzorky byly ponechány k inkubaci po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C ve vodní lázni. Po krátkém odstředění byl ke vzorkům přidán 1 µl trypsinu (1 µg/µl) a pokračovalo se v inkubaci dalších 12-16 hodin při 37 °C. Štěpení proteinů bylo ukončeno přidáním kapky kyseliny mravenčí (FA).

Okyselené vzorky byly lyofilizovány a podrobeny purifikaci peptidů pomocí monospinových kolon C-18. Před použitím byly kolony C-18 kondicionovány methanolem a vodou a dále ekvilibrovány 3% ACN v 0,1% FA. Lyofilizované vzorky byly rozpuštěny v 3% ACN v 0,1% FA a vloženy na kolony C-18, kde se nechaly 10 minut vázat. Vzorky prošly kolonami dvakrát, aby se zajistila úplná vazba. Po 10 přísných promytích 3% ACN v 0,1% FA byly natrávené peptidy eluovány nejprve ve 40% ACN a poté dvakrát v 60% ACN. Nakonec byly tři eluáty spojeny a lyofilizovány, pro každé opakování.

Eluované peptidy byly znovu rozpuštěny v 500 µl 5 mM mravenčanu amonného (pH 2,5) ve 30% ACN a jemně promíchány. Kationtovýměnná kazeta byla před načtením vzorku fixována a kondicionována. Po vložení vzorku byla kazeta třikrát promyta 5 mM mravenčanem amonným (1 ml). Peptidy byly znovu vymyty dvakrát 400 µl 500 mM mravenčanu amonného (pH 2,5) ve 30% ACN na eluci a eluáty byly spojeny pro každou replikaci vzorku a lyofilizovány.

Masová spektrometrie Experimentální návrh a statistické zdůvodnění

LC-MS/MS analýza

Všechny vzorky byly analyzovány pomocí nanoprůtokové kapalinové chromatografie na systému nanoflex (Eksigent Technologies, AB Sciex) spojeném s trojitým hmotnostním spektrometrem TOF 5600 (AB Sciex; Concord, Kanada). Každé biologické opakování bylo vstříknuto dvakrát jako technické opakování. Systém pracoval s binárním fázovým gradientem s rozpouštědlem A (2 % ACN v 0,1 % FA) a rozpouštědlem B (98 % ACN v 0,1 % FA). Pro optimální reprodukovatelnost dodávky vzorku byl automatický vzorkovač provozován v režimu plného nástřiku s přeplněním 1 µl smyčky 3 µl vzorku. Pro měření každého nástřiku vzorku byly peptidy zachyceny na pasti cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) a separovány na koloně cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) při průtoku 300 nl/minutu za použití lineárního gradientu: 5-60 % rozpouštědla B za 80 minut, 60-90 % po dobu 2 minut. Kolona byla regenerována promytím 90% rozpouštědlem B po dobu 6 minut a reekvilibrována 5% rozpouštědlem B po dobu 22 minut.

Hmotnostní spektrometr byl spojen s iontovým zdrojem Nano Spray (AB Sciex), řízeným softwarem Analyst (v.1.6). Iontový zdroj byl vybaven 10 μm emiterem SilicaTip electrospray PicoTip (AB Sciex) a eluované peptidy byly sledovány pomocí následujících parametrů iontového zdroje – IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, clonící plyn = 25. Iontový zdroj byl vybaven iontovým paprskem o průměru 10 μm. Hmotnostní spektrometr pracoval v režimu informačně závislé akvizice (IDA) top10 a v režimu vysoké citlivosti s akumulační dobou 500, resp. 200 ms pro skeny MS1 a MS2 a dynamickou exkluzí 12 s, což vedlo k celkovému pracovnímu cyklu ~2,55 s. Analýza hmotnostního spektrometru byla provedena pomocí TOF-MS1 a MS2 survey skenů v rozsahu 350-1250, resp. 140-1600 m/z. V tomto pořadí byly provedeny dvě analýzy. Energie valivých srážek byla automaticky řízena pomocí skriptu IDA rolling collision energy parameter. Kritéria výběru mateřského iontu, který má být fragmentován, zahrnovala intenzitu – kde ionty musely být větší než 150 cps, hmotnostní toleranci 50 mDa, se stavem náboje +2 až +5. Automatická kalibrace spekter byla provedena po akvizici každých 2 vzorků pomocí dynamické LC-MS a MS/MS akvizice 25fmol β-galaktosidázy.

Zpracování a analýza dat

MS-MS akvizice Akt1 a jeho interagujících proteinových partnerů byla zprostředkována ve 3 různých fázích buněčného cyklu, tj. ve fázi G0, G1/S a G2. Buňky značené SILAC reprezentující každou fázi byly sdruženy do tří samostatných sad a zkoumány jako biologické repliky. Výsledkem získávání každé biologické repliky byly 2 soubory wiff a 2 soubory wiff.scan, které představovaly její technické repliky. Soubory wiff byly opět sdruženy pro každou biologickou repliku před vyhledáváním v databázi UniProtKB/SwissProt Human (vydání duben 2015) pomocí softwaru protein pilot, verze 4.5 (revize č. 1656). Referenční databáze se skládala z 20 204 záznamů proteinů v uvedeném vydání. Vyhledávání v proteinové pilotní databázi bylo založeno na algoritmu paragon, který je součástí výchozích statistik softwaru. Pro paragonové vyhledávání byla použita následující nastavení – (a) druh jako Homo sapiens, (b) Lys C a Trypsin jako kategorie enzymů pro různé běhy, (c) maximální počet chybějících štěpení = 2, (d) pevné modifikace jako značky SILAC – K6R6 a K8R10; alkylace cysteinu metylmethanethiosulfonátem (MMTS), e) variabilní modifikace jako oxidace na methioninu, což je výchozí volba v proteinovém pilotu, f) identifikace, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) a SILAC (Lys + 8, Arg + 10) jako typy vzorků a g) parametr „Search Effort“ „Thorough ID“, který nám umožňuje široké vyhledávání různých modifikací proteinů, h) hmotnostní tolerance pro prekurzorové a fragmentové ionty byla 0.05 a 0,1 Da. Pro každou biologickou replikaci na značku SILAC byly vygenerovány soubory Lys C a Trypsinem natrávené soubory. K filtrování dat byly použity následující parametry, aby se získal jistý soubor dat pro následnou analýzu – (a) byl použit algoritmus automatické korekce zkreslení pro poměr těžkých a lehkých dat. Ten koriguje nerovnoměrné promíchání během kombinace různých značených vzorků v jednom experimentu a odstraňuje jakoukoli experimentální nebo systematickou chybu. Faktor automatického zkreslení zvyšuje přesnost kvantifikace normalizací variací v počátečních množstvích proteinů45, (b) Byly ponechány proteiny s 1% globální mírou falešných objevů (FDR) z fitování (G-FDR-fit). Analýza FDR byla provedena pomocí softwaru PSPEP (Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software), který je nainstalován se softwarem Protein Pilot; c) minimální prahová hodnota spolehlivosti proteinu byla nastavena na 95 %; d) identifikace alespoň jednoho jedinečného peptidu s 95% spolehlivostí ve všech třech replikátech

Seznamy proteinů získaných po trávení Lys C a trypsinem byly sloučeny pro každou biologickou replikaci. Kvantitativní poměry mezi středně těžkými a těžkými proteiny značenými SILAC vzhledem k jejich lehčím protějškům byly zprůměrovány. Následně jsme získali tři seznamy proteinů pro každou značku SILAC – K0R0, K6R6 a K8R10. Následovala příprava svazového seznamu identifikovaných proteinů; kvantitativní odhad byl proveden ručně sloučením souborů ze tří biologických replikátů pro každou podmínku SILAC. Proteiny, které byly identifikovány ve všech třech souborech opakování, byly ponechány pro následnou analýzu a kvantitativní poměry mezi středními a těžkými značkami vzhledem k lehkým značkám pro tyto proteiny byly zprůměrovány. Poté byl připraven konečný kombinovaný soubor pro K0R0 (fáze G0), K6R6 (fáze G2) a K8R10 (fáze G1/S). Protein splňoval podmínky pro zařazení do konečného seznamu interaktorů Akt1 pouze v případě, že byl identifikován ve všech 3 souborech opakování pro některou z fází buněčného cyklu. Proteinům, které byly identifikovány, ale nebyly kvantifikovány ve všech třech opakováních, byla po vniknutí do peptidových poměrů SILAC přiřazena kvantifikační hodnota 0,01 (minimum) nebo 100 (maximum).

Pro další očištění seznamu Akt1 interaktorů od případných nespecifických interakcí s afinitní matricí nebo značkou jako takovou byl SH značený GFP nadměrně exprimován v buňkách HEK293. Interakční partneři proteinu GFP byli selektivně eluováni, jak bylo popsáno pro proteinové komplexy Akt1. Proteiny, které se překrývaly s interakcemi specifickými pro fázi buněčného cyklu Akt1, byly ze seznamu interaktorů Akt1 odstraněny jako nespecifické proteiny. Tím jsme nakonec získali jistý soubor dat pro interakční partnery Akt1. Souhrn informací o proteinech interagujících s Akt1 a odhady jejich kvantity jsou uvedeny v doplňkové tabulce 3. Jejich dělením s poměrem Akt1 v příslušné fázi jsme normalizovali kvantitativní poměry pro všechny akt1 interaktory. Tím bylo dosaženo jednotnosti Akt1 jako 1 ve fázích G0, G1/S a G2.

Polyakrylamidová gelová elektroforéza a Western blotting

Ze seznamu identifikovaných Akt1 interaktorů byly náhodně vybrány CDK1, CCNB1, BUB3, API5 a SH3PX1 k ověření jejich asociace s Akt1 pomocí Western blotu. Pelet asynchronizovaných buněk exprimujících Akt1 byl lyzován v IP pufru a podroben afinitní purifikaci zaměřené na SH značku, jak bylo popsáno dříve. Eluáty byly sloučeny a naředěny v 1X SDS vzorkovacím pufru a zahřívány po dobu 10 minut a rozlišeny na 10% SDS-PAGE. Proteinové pásy byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu a ta byla blokována pomocí blokovacího pufru 1:1 odyssey: PBS po dobu jedné hodiny při pokojové teplotě. Poté byla membrána rozříznuta, aby bylo možné sondovat proteiny různých velikostí příslušnými primárními protilátkami k validaci spolu s protilátkou anti-HA. Ředění primární protilátky bylo provedeno v odyssey pufru: PBST a inkubovalo se přes noc při 4 °C na třepačce. Po důkladném promytí byly bloty vystaveny příslušným IR značeným sekundárním protilátkám proti myším nebo králíkům v ředění 1:15000; ředěno v odyssey pufru: PBST. Pásy byly detekovány pomocí infračerveného skeneru odyssey.

Reverzní koimunoprecipitace byla rovněž provedena pomocí Dynabeads protein A. Jako návnadové proteiny byly použity dříve detekované interaktory Akt1 a Akt1 byl sondován jako jejich interakční partner pomocí protilátky anti-Akt1. Protilátky proti vybraným Akt1 interaktorům byly smíchány s 50 µl dynabeads v oddělených zkumavkách v koncentraci 1:20-1:70; ředily se ve 200 µl PBST. Směsi kuliček a protilátek byly ponechány k inkubaci při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Komplexy kuliček a protilátek byly peletovány pomocí magnetického separátoru a znovu suspendovány v 200 µl PBST pro promytí. Poté bylo do každé zkumavky přidáno 250 µl lyzátu a inkubovalo se při 4 °C po dobu 2 hodin na rotační třepačce. Kuličky spolu s příslušnými komplexy protilátka-antigen byly opět peletovány a třikrát promyty 200 µl PBST na jedno promytí. Poté byly kuličky vařeny v 50 µl 1X SDS vzorkovacího pufru po dobu 10 minut a následně ochlazeny. Supernatant byl nanesen na 10% SDS-PAGE a vyšetřen metodou western blottingu. Protilátka proti Akt1 byla použita k sondování Akt1 v eluci API5, CCNB1, CDK1, BUB3 a SH3PX1.

KlasifikaceGO

TřídyGO znázorňující funkci jednotlivých interaktorů Akt1 byly určeny z databází UniProt (http://www.uniprot.org/) a EnrichR (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Po rozsáhlé ruční kurátorské úpravě byly identifikované interaktory Akt1 rozděleny do 3 hlavních funkčních tříd, tj. proliferace a přežívání; metabolismus a syntéza proteinů. Zbytek byl znázorněn jako společná třída nazvaná „ostatní“, která zahrnovala proteiny s funkcemi, jako je transport, hematopoéza atd.

Vyřazení genu pomocí siRNA

Standardizace

Pro stanovení optimální koncentrace siRNA pro transfekci bylo do 12jamkové destičky nasazeno 1,2 × 105 buněk HEK293. siRNA proti PLK1 byla použita jako pozitivní kontrola ve všech testech vyřazení. Rozsah koncentrací siRNA od 10 nM do 50 nM byl transfekován pomocí transfekčního činidla dharmafect podle protokolu dodavatele. Změny v hladinách exprese proteinů byly sledovány pomocí western blotu po 24 hodinách, 48 hodinách a 72 hodinách (doplňkový obrázek 2). Několik dalších cílů (SH3PX1, AKT1, CCNB1 a SLC25A5) bylo vyřazeno a účinek vyřazení byl stanoven pomocí western blotu. Jako kontrola zatížení byl použit GAPDH.

Knockdown cílových proteinů

Proteiny vykazující narušenou asociaci s Akt1 při přechodu buňky z fáze G0 do G1/S buněčného cyklu byly v buňkách HEK293 knockdownovány jednotlivě a zkoumány pomocí FACS. Každá siRNA byla resuspendována v 1x siRNA pufru, aby se získala zásobní koncentrace 20 µM. Transfekce byla zprostředkována ve třech opakováních 24 hodin po nasazení buněk; spolu s příslušnými pozitivními a negativními kontrolami. Každá siRNA byla naředěna na pracovní koncentraci 25 nM v RPMI na konečný objem 50 µl a ponechána při pokojové teplotě po dobu 5 minut inkubace. Podobně bylo transfekční činidlo rovněž naředěno v RPMI na objem 50 µl a uchováváno pro inkubaci za podobných podmínek. SiRNA i transfekční činidlo se jemně promíchaly, aby se vytvořily komplexy, a pokračovalo se v inkubaci dalších 20 minut při pokojové teplotě. Konečný objem byl doplněn na 500 µl médiem obsahujícím 10% sérum. Tyto komplexy byly poté opatrně přidány na buňky a pokračovalo se v inkubaci při 37 °C. Po 24 hodinách bylo médium buněčné kultury nahrazeno čerstvým 10% médiem. Nakonec byla 48 hodin po transfekci stanovena účinnost transfekce sledováním siGLO pod inverzním mikroskopem Nikon Ti.

Získání a analýza FACS

Po 48 hodinách po transfekci byly buňky krátce odstředěny a médium bylo odsáto. Buňky byly obarveny 300 µl roztoku propidium jodidu obsahujícího 0,1 mg/ml propidium jodidu (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml citrátu sodného (Sigma) a 20 µg/ml RNázy (Sigma) po dobu 30 minut při 4 °C. Obarvené buňky byly okamžitě přeneseny do zkumavek BD FACS a získány v programu BD FACS Canto.

Získaná data byla analyzována pomocí softwaru FlowJo. Histogramy DNA byly analyzovány za účelem kvantifikace sub G0, G0/G1, S a G2/M populací. V populacích G0/G1 a G2/M byly pozorovány drobné posuny, a proto bylo pro analýzu těchto populací provedeno manuální gating.

Výpočet PDT a RT

PDT a RT ve fázích G1, S a G2 buněčného cyklu byly vypočteny po vyřazení siRNA souboru proteinů, které vykazovaly narušenou asociaci s Akt1 ve fázi G1/S. PDT pro 23 genů spolu s kontrolami byla sledována v buňkách HEK293 po dobu 72 hodin. Stručně řečeno, 10 000 buněk bylo nasazeno do 96jamkové destičky do 100 µl RPMI média s 10% sérem. siRNA transfekce byla zprostředkována následující den ve třech opakováních pro každý cílový protein a byla považována za časový bod 0 hodin. Počet buněk byl stanoven pro neošetřené buňky HEK293 metodou barvení trypanovou modří. Po 24 hodinách bylo médium buněčné kultury obsahující komplexy siRNA nahrazeno čerstvým RPMI obsahujícím 10% sérum. Poté byly spočítány buňky pro každou z buněk transfekovaných siRNA, což představuje časový bod 24 hodin. Následně byl soubor buněk běžících v paralelní kultuře odebrán a spočítán v časových bodech 48 hodin a 72 hodin.

Po stanovení PDT pro celou cílovou sadu narušených genů byl RT (v hodinách) pro každý z nich vypočítán pro fáze G1, S a G2 následujícím způsobem:

where; % populace buněk bylo stanoveno pomocí FACS.

Data Availability

Data z hmotnostní spektrometrie byla uložena jako datová sada „Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as the function of cell cycle progression.“ na ProteomeXchange prostřednictvím databáze PRIDE. Jsou veřejně dostupná prostřednictvím služby ProteomeXchange s identifikátorem ProteomeXchange: PXD005557. Soubor dat se skládá z 12 nezpracovaných souborů (wiff a wiff.scan) a souvisejících 18 pilotních souborů proteinů.

.